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World File Search System电穿孔
利用微流体电穿孔器对血液中的耐药癌细胞进行敏感
直接评估患者样本在癌症治疗中具有前所未有的潜力。液体活检中的循环肿瘤细胞 (CTC) 是临床中快速发展的原发细胞来源，是实时揭示肿瘤信息的功能分析的理想候选者。然而，缺乏允许直接从液体活检样本中直接主动询问 CTC 的常规方法，这是液体活检在临床环境中转化应用的瓶颈。为了解决这个问题，我们提出了一种使用微流体涡旋辅助电穿孔系统的工作流程，该系统设计用于对从血液中纯化的 CTC 进行功能评估。通过对野生型 (HCC827 wt) 和吉非替尼耐药 (HCC827 GR6) 非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞进行药物反应分析来评估对该方法的验证。被困在微尺度涡旋中的 HCC827 细胞被电穿孔以依次将药物输送到细胞溶胶中。使用自动单细胞图像荧光强度算法，对两种细胞系的电穿孔条件进行了表征，以促进多种药物的递送。能够以高纯度收集掺入血液以模拟耐药 CTC 的 HCC827 GR6 细胞，表明该装置能够最大限度地减少下游敏感细胞检测的背景细胞影响。使用我们提出的工作流程，恢复吉非替尼敏感性的药物组合反映了预期的细胞毒性反应。总之，这些结果代表了一种微流体多药筛选面板工作流程，可以实现对患者 CTC 的原位功能询问，从而加速液体活检的临床标准化。
使用AAV介导的2- ...
CRISPR-CAS基因组编辑技术的最新进展在提高效率方面产生了重要的作用，以产生基因修饰的动物模型。在这项研究中，我们结合了四种非常有前途的方法，以提出高效的管道来产生敲击小鼠和大鼠模型。四种组合方法包括：AAV介导的DNA递送，单链DNA供体模板，2细胞胚胎修饰和CRISPR-CAS核糖核蛋白（RNP）电穿孔。使用这种新的组合方法，我们能够成功地产生含有CRE或FLP重组酶序列的成功靶向敲击大鼠模型，具有超过90％的敲击效率。此外，我们能够产生一个含有CRE重组酶靶向插入的敲门小鼠模型，其效率超过50％，将效率直接比较与其他常用方法。我们使用2细胞胚胎CRISPR-CAS9 RNP电穿孔技术进行了修改的AAV介导的DNA递送，已证明对生成敲入小鼠和敲门大鼠模型非常有效。
tcbuster非病毒基因工程
G-Rex生物反应器中Tcbuster编辑的细胞的转置和膨胀速率。越来越多的细胞（1x10 7、8x10 7和40x10 7）被电穿孔引入TCBUSTER，然后分别播种到小，中和大规模的G-Rex生物反应器中，以进行膨胀。tcbuster成功地转移了效率> 30％的细胞，并在G-Rex中导致25、50和38倍的膨胀。
Alt-R HDR 设计工具和 HDR 供体寡核苷酸
图 1.与其他修饰相比，具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 图 1.与其他修饰相比，具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 （A）供体寡核苷酸修改的示意图。 （B）每次修改的 HDR 效率。使用 4D-Nucleofector™ 系统（Lonza）将四个靶向基因位点的 RNP 复合物（2 µM）与 0.5 µM 单链 HDR 供体寡核苷酸通过电穿孔共转染到 Jurkat 和 HeLa 细胞中。使用的 RNP 复合物是 Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3，以及 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 和 tracrRNA。 使用了三种类型的供体寡核苷酸：未经任何修饰的寡核苷酸（未修饰的）、具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸（PS 修饰的）和具有 Alt-R HDR 修饰的寡核苷酸（Alt-R HDR 修饰的）。 电穿孔后 48 小时 (HeLa) 或 72 小时 (Jurkat) 提取基因组 DNA。通过在 Illumina™ MiSeq™ 系统 (v2 化学、150 bp 双端读取) 上进行扩增子测序来测量 HDR 效率。
一种新型的非病毒递送方法，可实现原代人T细胞的有效工程进行体内细胞治疗应用
背景目的：下一代免疫细胞治疗产品将需要使用可以维持高水平细胞功能的工程技术进行复杂的修饰。非病毒工程方法具有解决与病毒载体相关的局限性的潜力。但是，尽管电穿孔是最广泛使用的非病毒模式，但对其对细胞功能的影响的担忧导致了替代方法的探索。在这里，作者研究了索洛波尔非病毒递送系统对工程原代人T细胞用于细胞治疗应用的适用性。方法：使用索洛波尔系统来传递信使RNA（mRNA），并定期间隔短的短静脉重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（CAS9）指南RNA核糖核蛋白（RNP）Cargos与T细胞，并效率均匀地测量。通过免疫基因表达填充评估细胞扰动，包括电穿孔比较器。 分别使用实时细胞阻抗测定法和Raji-luciferase小鼠肿瘤模型评估了使用Solupore系统产生的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的体内和体内细胞毒性。 结果：通过单独，同时和顺序地使用Solupore系统分别，同时和顺序地递送MRNA和CRISPR CAS9 RNP Cargos来证明有效的转染，同时始终保持高水平的细胞活力。 基因表达促进显示免疫基因表达的改变很小，这表明细胞在此转染过程中经历的扰动水平低。细胞扰动，包括电穿孔比较器。分别使用实时细胞阻抗测定法和Raji-luciferase小鼠肿瘤模型评估了使用Solupore系统产生的嵌合抗原受体（CAR）T细胞的体内和体内细胞毒性。结果：通过单独，同时和顺序地使用Solupore系统分别，同时和顺序地递送MRNA和CRISPR CAS9 RNP Cargos来证明有效的转染，同时始终保持高水平的细胞活力。基因表达促进显示免疫基因表达的改变很小，这表明细胞在此转染过程中经历的扰动水平低。通过骗局，电穿孔导致T细胞中免疫基因表达的显着变化。CAR T细胞在体外和体内表现出针对靶心癌细胞的有效细胞毒性。结论：Solupore系统是一种非病毒的手段，可以简单，快速，有效地将碳传递给原代人免疫细胞，并保留高细胞活力和功能性。©2021国际细胞与基因治疗学会。由Elsevier Inc.出版这是CC BY-NC-ND许可证（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）下的开放访问文章
RRD 研究与技术服务指南
小鼠胚胎操作………………………………………………………………………………………………………… 7 同类系小鼠的生成…………………………………………………………………………………………………… 7 转基因小鼠的生成………………………………………………………………………………………………………… 7 CRISPR/Cas9 基因组编辑系统……………………………………………………………………………………………… 8 基于 ES 细胞的基因敲除小鼠的生成（悬浮服务）…………………………………………… 8 ES 细胞建立（悬浮服务）………………………………………………………………………………… 8 小鼠净化…………………………………………………………………………………………………………… 8 大鼠净化…………………………………………………………………………………………………………… 8 子宫内电穿孔（悬浮服务）………………………………………………………………………………… 8多克隆抗体生产…………………………………………………………………………………………………… 8 狨猴供应………………………………………………………………………………………………………… 8 常用设施和材料…………………………………………………………………………………………………… 9
通过将CRISPR/CAS9系统电穿孔到Zygotes的一步生成多个基因编辑的猪，以减少异种抗原生物合成
摘要：异种抗原引起过度急性排斥并限制了种间异种移植的成功。因此，参与异种抗原生物合成的基因，例如GGTA1，CMAH和B4GALNT2，是改善异种移植结果的关键靶标。在这项研究中，我们引入了一种CRISPR/CAS9系统，同时使用电穿孔来靶向GGTA1，CMAH和B4GALNT2，以一步一代生成多个基因编辑的猪而没有异种抗原。首先，我们优化了针对GGTA1和CMAH的引导RNA（GRNA）相对于基因编辑的效率，并将电穿孔的胚胎与优化的GRNA和CAS9转移到受体Gilts中。接下来，当GGTA1，CMAH和B4GALNT2同时靶向GGTA1，CMAH和B4GALNT2时，我们优化了CAS9蛋白的浓度，并使用优化的条件同时靶向基因。我们实现了GGTA1 / CMAH双重编辑的猪和GGTA1 / CMAH / B4GALNT2三重编辑的猪的一步生成。免疫组织学分析表明异种抗原的下调。然而，这些多个基因编辑的猪是遗传镶嵌物，未能敲除一些异种抗原。尽管应解决镶嵌性，但电穿孔技术可能会成为旨在改善猪至人类异种移植的猪中一步生成多个基因修饰的主要方法。
多重编辑的小鼠概括羊毛猛mm象发作
图2。实验A和B：使用CRISPR/CAS9 RNP合子电穿孔在小鼠中进行基因编辑。（a）工作流程。我们将带有合成SGRNA的CAS9 RNP池进行了电穿孔（EP）。然后，我们将胚胎在体外培养为胚泡阶段，并基因分型，以估计编辑效率。接下来，我们将胚泡转移到替代物中进行动物生产实验。最后，我们在出生后21天从幼犬那里收集并从幼犬那里收集并进行了基因分型耳孔。（b）指南筛选。我们为每个目标基因设计了一个和八个指南，并筛选了每个指南，以编辑终端实验的效率。对于每个指南，平均总修饰效率（KO +意外编辑）作为灰色条呈现，KO效率作为未用于动物生产实验的指南的紫色棒，以及选择用于动物生产实验的指南的橙色条。栏的平均效率至少来自五个胚胎。每个圆圈代表一个单独的实验，其中包括从单个胚胎到多达18个胚胎池的数据。（c，e）小鼠的KO％曲线
医疗领域细胞支架的革命 - UCL Discovery
2004 年，静电纺丝因其在生物和医学科学中的实用性而被重新构想和研究，即直接将生物聚合物与细胞混合，并将该细胞悬浮液暴露于静电纺丝中。这些研究表明，尽管施加了数千伏的电压，但被静电纺丝的带有生物聚合物的细胞并没有受到从分子水平向上的任何损伤。后来人们发现，伴随的施加电流通常为纳安培。因此，从另一个角度看，在医学和临床科学中，有一种这样的电场驱动方法，即电穿孔，据报道，这种方法的电压为几百伏，电流为几十毫安，会损伤和杀死细胞。电穿孔中的电流是使细胞膜可渗透所必需的，从而使基因构建体能够进入细胞。不幸的是，在此过程中，大多数细胞无法修复其渗漏的膜，因此死亡。这是大多数遗传学家学会忍受的权衡，因此产生了低存活率的转染细胞群。2006 年，直接电纺细胞的能力被创造出来，现在被称为“细胞电纺”。迄今为止，细胞电纺已被探索用于处理 600 多种不同类型的细胞，从原核到真核、哺乳动物和其他细胞类型，包括干细胞和整个受精胚胎。