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基于吸附性二氧化硅纳米结构的体内递送增强治疗性核糖核蛋白的基因编辑和碱基编辑
基因组编辑工具广泛安全应用的关键是将核糖核蛋白 (RNP) 的多种成分安全有效地递送到单细胞中，但这仍是其临床应用的生物障碍。为了解决这个问题，设计了一种基于生物相容性海绵状二氧化硅纳米结构 (SN) 的强大 RNP 递送平台，用于储存和直接递送治疗性 RNP，包括 Cas9 核酸酶 RNP (Cas9-RNP) 和碱基编辑器 RNP (BE-RNP)。与基于脂质的方法等商业化材料相比，通过靶向各种细胞和基因，可获得高达 50 倍的基因删除和 10 倍的碱基替换效率，且脱靶效率低。特别是，通过体内实体瘤模型中的静脉注射和小鼠眼中视网膜下注射的基于 SN 的递送成功诱导基因校正。此外，由于其毒性低、生物降解性高，SN 对器官细胞功能的影响微乎其微。由于工程化的 SN 可以克服与治疗性 RNP 应用相关的实际挑战，因此人们强烈期望该平台能够成为模块化 RNP 递送系统，从而促进体内基因删除和编辑。
![b'sandwich排列，其中包含捕获目标 - 信号探针。随后通过监测被观察到的甲基蓝（MB）的峰值电流变化来检测到所得的DNA杂交事件，该脉冲伏安法（DPV）被用作氧化还原物种的峰值电流变化，并实现了35 AM的检测极限。 Wang等。 [5]开发了一种基于RGO和锰四苯基 - 苯基苯基苯基二磷酸结构的自组装纳米复合材料的DNA生物传感器，从而导致6 \ XC3 \ X9710 14 M.的检测极限。 [6]采用了由捕获DNA序列组成的转换界面，在玻璃碳电极上官能化RGO，以构造无标记的DNA生物传感器，并达到了4.28 \ XC3 \ X9710 19 M.的检测极限。 Chen等。 [7]还基于由氧化铜纳米线和羧基官能化的单壁碳纳米管（SWCNT）组成的杂化纳米复合材料（SWCNTS）开发了特定的序列DNA检测。 DNA检测是通过循环伏安法和3.5 \ xc3 \ x9710 15 m的检测极限。周等人。 [8]使用化学的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记的电化学检测进行了无标记的电极。他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。在另一个](/simg/9/95e0d0afb2a6a7d5d7547557c83da02f0068910b.webp)
b'sandwich排列，其中包含捕获目标 - 信号探针。随后通过监测被观察到的甲基蓝（MB）的峰值电流变化来检测到所得的DNA杂交事件，该脉冲伏安法（DPV）被用作氧化还原物种的峰值电流变化，并实现了35 AM的检测极限。 Wang等。 [5]开发了一种基于RGO和锰四苯基 - 苯基苯基苯基二磷酸结构的自组装纳米复合材料的DNA生物传感器，从而导致6 \ XC3 \ X9710 14 M.的检测极限。 [6]采用了由捕获DNA序列组成的转换界面，在玻璃碳电极上官能化RGO，以构造无标记的DNA生物传感器，并达到了4.28 \ XC3 \ X9710 19 M.的检测极限。 Chen等。 [7]还基于由氧化铜纳米线和羧基官能化的单壁碳纳米管（SWCNT）组成的杂化纳米复合材料（SWCNTS）开发了特定的序列DNA检测。 DNA检测是通过循环伏安法和3.5 \ xc3 \ x9710 15 m的检测极限。周等人。 [8]使用化学的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记的电化学检测进行了无标记的电极。他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。在另一个
b'sandwich排列，其中包含捕获目标 - 信号探针。随后通过监测观察到的亚甲基蓝（MB）的峰值电流变化来检测所得的DNA杂交事件，该峰值电流变化被用作氧化还原物种，并实现了35 AM的检测极限。Wang等。 [5]基于RGO和锰四苯基孢子的A \ XCF \ X80-偶联结构的自组装纳米复合材料开发了DNA生物传感器，导致6 \ xc3 \ x9710 14M的检测极限，在另一项研究中，在另一项研究中，Ye等。 [6]采用了一个转导界面，该界面由捕获的DNA序列，Aunps和Thionines在玻璃碳电极上官能化RGO来构建无标记的DNA生物传感器，并获得了4.28 \ xc3 \ x9710 199的检测极限。 Chen等。 [7]还基于由氧化铜纳米线和羧基官能化的单壁碳纳米管（SWCNT）组成的杂化纳米复合材料（SWCNTS）开发了特定的序列DNA检测。 DNA检测是通过循环伏安法和3.5 \ xc3 \ x9710 15 m的检测极限。 Zhou等。 [8]使用化学上的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记电化学检测进行了。 他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。 在另一项研究中，Zhang等人。 [9]为特定序列检测制造了无标记的DNA传感器。Wang等。[5]基于RGO和锰四苯基孢子的A \ XCF \ X80-偶联结构的自组装纳米复合材料开发了DNA生物传感器，导致6 \ xc3 \ x9710 14M的检测极限，在另一项研究中，在另一项研究中，Ye等。[6]采用了一个转导界面，该界面由捕获的DNA序列，Aunps和Thionines在玻璃碳电极上官能化RGO来构建无标记的DNA生物传感器，并获得了4.28 \ xc3 \ x9710 199的检测极限。Chen等。 [7]还基于由氧化铜纳米线和羧基官能化的单壁碳纳米管（SWCNT）组成的杂化纳米复合材料（SWCNTS）开发了特定的序列DNA检测。 DNA检测是通过循环伏安法和3.5 \ xc3 \ x9710 15 m的检测极限。 Zhou等。 [8]使用化学上的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记电化学检测进行了。 他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。 在另一项研究中，Zhang等人。 [9]为特定序列检测制造了无标记的DNA传感器。Chen等。[7]还基于由氧化铜纳米线和羧基官能化的单壁碳纳米管（SWCNT）组成的杂化纳米复合材料（SWCNTS）开发了特定的序列DNA检测。DNA检测是通过循环伏安法和3.5 \ xc3 \ x9710 15 m的检测极限。Zhou等。 [8]使用化学上的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记电化学检测进行了。 他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。 在另一项研究中，Zhang等人。 [9]为特定序列检测制造了无标记的DNA传感器。Zhou等。[8]使用化学上的RGO电极通过差分脉冲伏安法对ssDNA和dsDNA中的四个DNA碱基的无标记电化学检测进行了。他们达到了2.0 \ XCE \ XBC M的检测极限，线性浓度范围为0.01至10 mm。在另一项研究中，Zhang等人。 [9]为特定序列检测制造了无标记的DNA传感器。在另一项研究中，Zhang等人。[9]为特定序列检测制造了无标记的DNA传感器。将DNA固定在用石墨烯，Aunps和Polythionine（Pthion）修饰的玻璃碳电极上。通过不同的脉冲伏安法检测到杂交，并且在0.1 pm至10 nm的动态范围内达到了35 fm的检测极限。Bo等人开发了石墨烯和聚苯胺的电化学DNA生物传感器。[10]用于DPV检测辅助DNA序列，并达到了'
以碱基分辨率 1 对基因调控元件进行综合解剖
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2022 年 10 月 6 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.10.05.511030 doi：bioRxiv 预印本
使用基于 T7 RNAP 的随机 DNA 碱基编辑器进行除草剂抗性的合成进化
通过局部序列多样化和同时施加选择压力的合成定向进化是一种很有前途的方法，可用于产生影响不同物种感兴趣性状的新的有益等位基因；然而，这种技术很少应用于植物。在这里，我们设计、构建并测试了 T7 RNA 聚合酶 (RNAP) 和脱氨酶的嵌合融合物，以实现感兴趣的目标序列的局部序列多样化。我们在本氏烟瞬时测定中测试了我们的 T7 RNAP - DNA 碱基编辑器，以靶向在 T7 启动子控制下表达 GFP 的转基因，并观察到 C 到 T 的转换。然后，我们靶向已稳定整合到水稻基因组中的 T7 启动子驱动的乙酰乳酸合酶序列并产生 C 到 T 和 G 到 A 的转换。我们利用除草剂处理作为乙酰乳酸合酶序列进化的选择压力，导致除草剂反应残基的富集。然后我们在转基因水稻植物中验证了这些除草剂反应区域。因此，我们的系统可用于基因功能的持续合成进化，以产生具有改进的除草剂抗性的变体。
通过单次静脉注射载体进行体内碱基编辑以治疗血红蛋白病
简介 自体造血干细胞 (HSC) 基因疗法治疗血红蛋白病已显示出良好的临床疗效 (1–4)。然而，目前的方案包括分离患者 HSC、使用整合载体进行体外基因改造以及在骨髓毒性 BM 调理后重新输注改造后的 HSC，这些方案在技术上很复杂且成本高昂。我们正试图开发一种体内 HSC 基因治疗方法，这种方法不需要骨髓消融和整合载体，而且在技术上更容易。在这种方法中，我们使用衣壳修饰的辅助依赖性 HDAd5/35++ 载体 (1, 2)。这些载体靶向 CD46，这是一种在原始 HSC 上表达的受体 (2, 3)。在通过常规用于 HSC 动员/收获的药剂将 HSC 从 BM 动员后，将 HDAd5/35++ 载体静脉注射。动员的 HSC 在周围时被转导。大部分 HSC 返回 BM。动员造血干细胞对于体内转导至关重要，因为在骨髓中，造血干细胞被细胞外基质蛋白包围（4），基因转移载体无法接触（2）。为了扩增体内转导的造血干细胞，我们目前使用一种基于突变 O 6 -甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（mgmt P140K）基因的体内选择机制，该基因可产生对 O 6 -BG/BCNU 的抗性
重编程蓝藻聚球藻的碱基编辑
。CC-BY-NC-ND 4.0 国际许可证下可用（未经同行评审认证）是作者/资助者，他已授予 bioRxiv 永久展示预印本的许可。它是此预印本的版权持有者此版本于 2022 年 9 月 6 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.09.05.506134 doi：bioRxiv 预印本
利用 TadA 的下一代胞嘧啶碱基编辑器
• 脱氨酶的定向进化 • PAM 变体碱基编辑器 • 定向进化 Cas9 以创建用于 BE 的非 NGG PAM 变体 • 密码子、NLS 和接头优化 • 环状置换体和镶嵌碱基编辑器 • DNA 脱靶评估 • RNA 脱靶评估 • 旁观者编辑最小化 • 引导 RNA 工程 • 离体和体内 BE 递送 • 最小化脱靶活性的工程 BE • HSC、肝细胞和 T 细胞的离体碱基编辑 • ABE 的低温电子显微镜结构 • 小鼠体内碱基编辑 • 非人类灵长类动物体内编辑
碱基编辑工具在单基因疾病基因治疗中的转化潜力
全球有数百万人患有由 DNA 序列各种突变引起的罕见遗传病。罕见遗传病的传统治疗方法往往无效，因此人们对基因编辑方法寄予厚望。基于 nCas9（具有切口酶活性的 Cas9）或 dCas9（催化无活性的 DNA 靶向 Cas9 酶）的 DNA 碱基编辑系统能够在不造成双链断裂的情况下进行编辑。这些工具在不断改进，增加了它们在治疗中的潜在用途。在这篇综述中，我们描述了主要类型的碱基编辑系统及其在体外和体内实验中治疗单基因疾病的应用。此外，为了了解这些系统的治疗潜力，我们还研究了碱基编辑系统的优缺点。
具有最小化脱靶效应和分子尺寸的胞嘧啶碱基编辑系统
胞嘧啶碱基编辑能够在不造成 DNA 双链断裂的情况下安装特定点突变，这对基因治疗等各种应用都有好处，但需要进一步降低脱靶风险并开发有效的递送方法。在这里，我们展示了基于结构的胞嘧啶碱基编辑系统 Target-AID 的合理工程设计，以最大限度地减少其脱靶效应和分子大小。通过密集而仔细的截断，其脱氨酶 PmCDA1 的 DNA 结合域被消除，并引入额外的突变以恢复酶功能。所得的 tCDA1EQ 在与 Cas9 的 N 端融合（AID-2S）或镶嵌结构（AID-3S）中有效，显示出最小化的 RNA 介导的编辑和 gRNA 依赖性/非依赖性的 DNA 脱靶，如在人类细胞中评估的那样。与较小的Cas9直系同源系统（SaCas9）结合，创建在AAV载体大小限制内的胞嘧啶碱基编辑系统。
利用 RNA 病毒载体在拟南芥中进行可遗传的碱基编辑
拟南芥中的可遗传碱基编辑可在 CESA3 处产生获得功能突变。A，纤维素合酶 3 (CESA3) 中的 esgRNA 靶标。C 到 T 的转变诱导