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World File Search System等位基因
仅敲除 LincRNA#1 不会影响凯尔特 POLLED 等位基因杂合牛的无角表型
长基因间非编码 RNA（lincRNA#1）在无角牛胎儿的角芽区过度表达，表明其可能在角芽抑制中发挥作用。使用基因组编辑来测试此序列的缺失是否与角表型有关。将两个具有高突变效率的 gRNA 靶向 lincRNA#1 序列两侧的 5′ 和 3′ 区域，在授精后 6 小时与 Cas9 一起作为核糖核蛋白复合物注射到牛受精卵（n = 121）中。在产生的囊胚（n = 31）中，84% 具有预期的 3.7 kb 缺失；在这些具有 3.7 kb 缺失的胚胎中，88% 是双等位基因敲除。将 39 个推测已编辑的 7 天囊胚移植到 13 头同步受体母牛体内，导致 10 例妊娠，其中 5 个胚胎在 POLLED 基因座上为显性 PC POLLED 等位基因杂合子，5 个胚胎为隐性 pp 基因型。产生的胎儿中有 8 个 (80%) 为双等位基因 lincRNA#1 敲除，其余两个为嵌合体。RT-qPCR 分析用于确认敲除胎儿中不存在 lincRNA#1 表达。对基因型 (PC p) POLLED 、lincRNA#1 敲除胎儿的表型和组织学分析显示，其形态与未编辑的对照无角胎儿相似，表明仅缺乏 lincRNA#1 不会导致有角表型。
双TAP基因驱动器使用迭代基因组靶向来帮助克服抗性等位基因
HOHING CRISPR基因驱动器可以帮助遏制媒介传播疾病的传播，并由于遗传率通过了孟德尔法律而控制作物害虫和入侵物种种群。然而，这项技术遭受了当驱动诱导的DNA断裂通过错误的途径修复时形成的电阻等位基因，这会产生破坏GRNA识别序列并阻止进一步基因驱动过程的突变。在这里，我们试图通过编码针对基因驱动器中最常见的抗性等位基因的其他GRNA来抵消这一点，从而在基因驱动转换时进行了第二次反应。我们提出的“双击”策略通过回收阻力等位基因改善了驱动效率。双击驱动器还有效地在笼中的种群中扩散，表现优于控制驱动器。总体而言，这种双重tap策略可以在任何基于CRISPR的基因驱动器中很容易实现，以提高性能，并且类似的绝对能力可以使其他患有低HDR频率的系统（例如哺乳动物细胞或小鼠种系转换）。
千的波兰基因组 - 波兰变体等位基因频率的数据库
1 MNM Bioscience Inc.，美国马萨诸塞州剑桥市02142，美国； elzbieta.kaja@gmail.com（e.k. ）; 26adrian.l@gmail.com（A.L. ）; dawid.sielski@mnm.bio（D.S. ）; mateusz.sypniewski@mnm.bio（M.S. ）; wojtaszewska@gmail.com（M.W。 ）; mmaria.stepien@gmail.com（M.S. ）; karolina.lisiak@mnm.bio（K.L.-T。）; fip.wolbach@mnm.bio（F.W. ）; daria.kolodziejska96@gmail.com（D.K. ）; katarzyna.ferdyn@gmail.com（k.f. ）; maciej.dabrowski@mnm.bio（M.D. ）; alicja.wozna@mnm.bio（A.W。 ）; paula.dobosz@gmail.com（p.d. ）; kasia@mnm.bio（K.Z. ）; pawel.zawadzki@mnm.bio（P.Z.） 2华沙内政和行政部中央临床医院，波兰华沙02-507； zbigniew.krol@cskmswia.pl（Z.J.K. ）; artur.zaczynski@cskmswia.pl（a.z. ）; agnieszka.pawlak@cskmswia.pl（A.P. ）; robert.gil@cskmswia.pl（R.G. ）; waldemar.wierzba@cskmswia.pl（W.W.）3医学化学与实验室医学系，波兹南医学科学大学，60-101 Poznan，波兰，波兰4 4遗传学和动物育种系，Pozna´n Life Sciences of Pozna´n Life Sciences of Life Sciences，60-637 Poznan，Poland 5波兰； tgambin@gmail.com 6医学遗传学系，母亲和儿童研究所，波兰华沙01-211； Mateusz.dawidziuk@imid.mid.pl 7 Biostatistics Group，Wrocław环境与生命科学大学，波兰弗罗茨瓦夫51-631； tomasz.suchocki@gmail.com（T.S. ）; jszyda@gmail.com（J.S。） ）; anna.bodora@gmail.com（A.B.-T。）; welikowski@wp.pl（W.E.）1 MNM Bioscience Inc.，美国马萨诸塞州剑桥市02142，美国； elzbieta.kaja@gmail.com（e.k.）; 26adrian.l@gmail.com（A.L.）; dawid.sielski@mnm.bio（D.S.）; mateusz.sypniewski@mnm.bio（M.S.）; wojtaszewska@gmail.com（M.W。）; mmaria.stepien@gmail.com（M.S.）; karolina.lisiak@mnm.bio（K.L.-T。）; fip.wolbach@mnm.bio（F.W.）; daria.kolodziejska96@gmail.com（D.K.）; katarzyna.ferdyn@gmail.com（k.f.）; maciej.dabrowski@mnm.bio（M.D.）; alicja.wozna@mnm.bio（A.W。）; paula.dobosz@gmail.com（p.d.）; kasia@mnm.bio（K.Z.）; pawel.zawadzki@mnm.bio（P.Z.）2华沙内政和行政部中央临床医院，波兰华沙02-507； zbigniew.krol@cskmswia.pl（Z.J.K.）; artur.zaczynski@cskmswia.pl（a.z.）; agnieszka.pawlak@cskmswia.pl（A.P.）; robert.gil@cskmswia.pl（R.G.）; waldemar.wierzba@cskmswia.pl（W.W.）3医学化学与实验室医学系，波兹南医学科学大学，60-101 Poznan，波兰，波兰4 4遗传学和动物育种系，Pozna´n Life Sciences of Pozna´n Life Sciences of Life Sciences，60-637 Poznan，Poland 5波兰； tgambin@gmail.com 6医学遗传学系，母亲和儿童研究所，波兰华沙01-211； Mateusz.dawidziuk@imid.mid.pl 7 Biostatistics Group，Wrocław环境与生命科学大学，波兰弗罗茨瓦夫51-631； tomasz.suchocki@gmail.com（T.S.）; jszyda@gmail.com（J.S。））; anna.bodora@gmail.com（A.B.-T。）; welikowski@wp.pl（W.E.）8波兰国家动物生产研究所，32-083 BALICE 9遗传学与生物技术研究所，华沙大学生物学学院，波兰02-106； p.golik@uw.edu.pl 10弗雷德里克·肖邦省专业医院血液学系，波兰35-055rzeszóW，11. m.mroczek888@gmail.com 12 Department of Infectious Diseases, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland 13 Department of Sports Medicine, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland 14 Medical and Science Sp. z o.o., 08-455 Podebłocie, Poland 15 Institute of Human Genetics Polish Academy of Sciences, 60-479 Poznan, Poland 16 Faculty of Physics, Adam Mickiewicz University, 61-614 Poznan, Poland 17 Department of Internal Medicine, J ó zef Stru´s Multidisciplinary Municipal Hospital, 61-285 Poznan,波兰； marcin.zytkiewicz@gmail.com（M。Z. 18波兰科学学院Mossakowski医学研究中心，波兰华沙02-106，191-091华沙大学临床中心血液学，移植和内科，波兰，波兰 *通信 *通信：Pawel.sztromwasser@mnm.mm.bio†这些授权撰稿人。8波兰国家动物生产研究所，32-083 BALICE 9遗传学与生物技术研究所，华沙大学生物学学院，波兰02-106； p.golik@uw.edu.pl 10弗雷德里克·肖邦省专业医院血液学系，波兰35-055rzeszóW，11. m.mroczek888@gmail.com 12 Department of Infectious Diseases, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland 13 Department of Sports Medicine, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland 14 Medical and Science Sp.z o.o., 08-455 Podebłocie, Poland 15 Institute of Human Genetics Polish Academy of Sciences, 60-479 Poznan, Poland 16 Faculty of Physics, Adam Mickiewicz University, 61-614 Poznan, Poland 17 Department of Internal Medicine, J ó zef Stru´s Multidisciplinary Municipal Hospital, 61-285 Poznan,波兰； marcin.zytkiewicz@gmail.com（M。Z.18波兰科学学院Mossakowski医学研究中心，波兰华沙02-106，191-091华沙大学临床中心血液学，移植和内科，波兰，波兰 *通信 *通信：Pawel.sztromwasser@mnm.mm.bio†这些授权撰稿人。
CRISPR/Cas9 介导的显性 COL6A1 致病变异的等位基因特异性破坏可改善患者成纤维细胞中的胶原蛋白 VI 网络
1 西班牙 Esplugues de Llobregat 08950，Santa Rosa 39-57，Institut de Recerca Sant Joan de Déu，神经肌肉疾病应用研究实验室，神经肌肉病理学科，神经儿科服务部； mariacarmen.badosa@sjd.es （CB）; alejandro.hernandez@uib.es（AH-D.）; daniel.natera@sjd.es（DN-dB）; carlos.ortez@sjd.es （科罗拉多州）; andres.nascimento@sjd.es（AN）; cecilia.jimenez@sjd.es (CJ-M.) 2 罕见疾病网络生物医学研究中心 (CIBERER), Av.西班牙马德里 28029 蒙福特德莱莫斯 3-5； matmorinro@yahoo.es （MM）; dgrinberg@ub.edu （总干事）； sbalcells@ub.edu （SB）； mopelayo@hotmail.com (M. Á .M.-P.) 3 Institut de Recerca Sant Joan de Déu, Santa Rosa 39-57, 08950 Esplugues de Llobregat, 西班牙； monica.roldan@sjd.es 4 遗传服务，Ram ón ny Cajal 大学医院，Ram ón ny Cajal 卫生研究所，Ctra。 Hive Old Km。 9,100, 28034 马德里，西班牙； sergio.fernandez@hrc.es 5 巴塞罗那大学生物医学研究所（IBUB）生物学院遗传学、微生物学和统计学系，巴塞罗那大学，Av. Diagonal 643, 08028 巴塞罗那，西班牙 6 共聚焦显微镜和细胞成像部门，遗传和分子医学服务中心，罕见病儿科研究所 (IPER)，Sant Joan de Déu 医院，Passeig Sant Joan de Deu, 2, 0895 通讯：通讯：lopez@sjd.es
一组荧光标记的 daf-16 等位基因
daf-16 编码一种广泛表达的转录因子，在多种发育和生理过程中发挥作用 (Lin et al., 1997; Ogg et al. , 1997; Tissenbaum, 2018)，包括在神经系统中 (Kim and Webb, 2017)。DAF-16 蛋白表现出高度动态的细胞质到核易位，过去曾使用多拷贝构建体进行可视化，这可能会产生潜在的过表达伪影（例如 (Henderson and Johnson, 2001) 中描述的那些）。为了避免这种过表达效应，生成荧光标记的 daf-16 等位基因将很有用。同样，生成 daf-16 的条件等位基因将有助于解决有关 daf-16 作用重点的许多悬而未决的问题。为了解决这两个问题，我们最近生成了一个带有 mNeonGreen 标记的 daf-16 等位基因，该等位基因还包含一个生长素诱导的降解子 (Bhattacharya 等人，2019；Zhang 等人，2015)。该等位基因 daf-16(ot853[daf- 16::mNG::AID]) 使我们能够为神经元类型特异性 daf-16 耗竭提供概念验证 (Bhattacharya 等人，2019)。该等位基因的一个问题是，由于其荧光标记 (mNeonGreen) 的发射光谱，它不能与基于 gfp 的表型读数结合使用。
unc-52 基因座的两个等位基因破坏了潜在的细胞......
图 1：A：NK358 pat-3::GFP 动物的肌肉细胞。虚线代表致密体（箭头），直线代表 M 线（箭头）；B：pat-3::GFP; unc-52(kq748) 动物的肌肉细胞。虚线代表致密体（箭头），直线（箭头）代表 M 线。定位看起来与图 1A 相似；C：N2 肌肉细胞的罗丹明偶联鬼笔环肽染色。沿肌肉长度的肌动蛋白细胞骨架被染色（箭头）；D：unc-52(kq748) 肌肉细胞的罗丹明偶联鬼笔环肽染色。细（肌动蛋白）丝（箭头）中没有明显异常。比例尺 = 10 µm。； E：unc-52 (kq748)（平均每秒 1.4454 次冲击，n=50）、unc-52(kq745)（平均每秒 1.339 次冲击，n=50）和 N2 野生型（平均每秒 1.99 次冲击，n=50）的冲击试验结果。 * 与 N2 野生型相比，p 值 < 0.05。
检测异质性骨髓瘤患者中的 CCR5Δ32 突变等位基因...
CC 趋化因子受体 5 型 (CCR5 或 CD195) 是人类免疫缺陷病毒 (HIV) 的辅助受体结合位点之一。移植具有 CCR5 Δ 32 敲除突变的造血干细胞可以作为彻底治愈 HIV 的有效工具；这些方法已经通过了原理验证阶段。同时，使用现代 CRISPR/Cas9 基因组编辑方法，我们可以在任何野生型细胞中有效地复制 CCR5 Δ 32 突变。因此，在异质细胞混合物中寻找和准确量化突变 CCR5 Δ 32 等位基因的含量变得至关重要。在本研究中，我们描述了使用 CRISPR/Cas9 生成人工 CCR5 Δ 32 突变，然后进行多重液滴数字聚合酶链式反应 (ddPCR) 以量化其在细胞混合物中的含量。我们开发的系统可以让我们快速准确地测量 CCR5 Δ 32 突变细胞的含量，精确度可达 0.8%。
利用 RNA 病毒在拟南芥中进行高效多重双等位基因遗传编辑
3 美国加利福尼亚州伯克利市加利福尼亚大学创新基因组学研究所 4 美国明尼苏达州圣保罗市明尼苏达大学遗传学、细胞生物学和发育系。5 美国明尼苏达州圣保罗市明尼苏达大学精准植物基因组学中心。6 美国明尼苏达州圣保罗市明尼苏达大学基因组工程中心。
结直肠癌细胞中 β -catenin 的等位基因特异性内源性标记和定量分析
摘要 Wnt 信号在发育、体内平衡和肿瘤发生中起着重要作用。在结直肠癌和肝细胞癌中发现了激活 Wnt 信号的 β -catenin 突变。然而，β -catenin 野生型和突变型的动态尚未完全了解。在这里，我们在结直肠癌细胞系中对内源性 β -catenin 的荧光标记等位基因进行了基因组工程改造。野生型和致癌突变等位基因用不同的荧光蛋白标记，从而能够在同一细胞中分析这两种变体。我们使用免疫沉淀、免疫荧光和荧光相关光谱法分析了两种 β -catenin 等位基因的特性，揭示了截然不同的生物物理特性。此外，通过用 GSK3 β 抑制剂或截短 APC 突变治疗激活 Wnt 信号，可以调节野生型等位基因，使其模仿突变 β -catenin 等位基因的特性。一步标记策略展示了如何利用基因组工程对不同的遗传变异进行并行功能分析。
CRISPR/Cas9 介导双等位基因 F0 海葵鱼 (Amphiprion ocellaris) 突变体的产生
基因组操作是一种有用的方法，可用于阐明发育、生理和行为方面的分子途径。然而，由于缺乏适用于珊瑚鱼的基因编辑工具，因此它们许多独特特征的遗传基础仍有待研究。一种适合应用这种技术的标志性珊瑚鱼群是海葵鱼 (Amphiprioninae)，因为它们与海葵共生、雌雄同体、复杂的社会等级、皮肤图案发展和视觉，并且相对容易在水族箱中饲养，因此被广泛研究。在这项研究中，我们开发了一种基因编辑方案，用于将 CRISPR/Cas9 系统应用于眼斑海葵鱼 (Amphiprion ocellaris)。受精卵的显微注射用于证明我们的 CRISPR/Cas9 方法在两个不同靶位点的成功应用：与视觉有关的视紫红质样 2B 视蛋白编码基因 (RH2B) 和与黑色素生成的酪氨酸酶生成基因 (tyr)。对眼斑海马胚胎中测序的靶基因区域进行分析表明，注射胚胎的吸收率高达 73.3%。进一步分析亚克隆的突变基因序列并结合扩增子散弹枪测序表明，我们的方法在 F0 眼斑海马胚胎中产生双等位基因突变的效率为 75% 到 100%。此外，我们清楚地显示了 tyr 突变胚胎的功能丧失，其表现出典型的低黑色素表型。该方案旨在作为进一步探索 CRISPR/Cas9 在眼斑海马中潜在应用的有用起点。眼斑鱼，作为研究小丑鱼和其他珊瑚鱼基因功能的平台。