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Transformer 碱基编辑器在哺乳动物细胞和小鼠中的设计与应用
将载脂蛋白 B mRNA 编辑酶、催化性多肽样胞苷脱氨酶与催化功能受损的 Cas 蛋白（例如 nCas9 或 dCas9）融合，提供了一种新型基因编辑技术，即碱基编辑，可高效地实现靶向碱基替换。然而，在碱基编辑中观察到全基因组和全转录组脱靶突变，这引发了对治疗应用的安全性担忧。之前，我们开发了一种新的碱基编辑系统，即 transformer 碱基编辑器 (tBE)，可在哺乳动物细胞和小鼠中诱导高效编辑，且不会观察到全基因组或全转录组脱靶突变。这里我们描述了设计和应用 tBE 的详细方案。本方案包括设计单向导 RNA (sgRNA) 和辅助 sgRNA 对、构建构建体、确定全基因组和转录组范围的脱靶突变、生产含有 tBE 的腺相关病毒、将腺相关病毒递送到小鼠体内以及检查体内编辑效果的步骤。使用 sgRNA-辅助 sgRNA 对，tBE 的高精度碱基编辑可以在 2-3 周内（在哺乳动物细胞中）或 6-8 周内（在小鼠中）完成。整个过程可以由研究人员使用分子生物学、生物信息学和小鼠饲养的标准技术共同完成。
用于癌症的激酶抑制剂会改变代谢、血糖......
小分子激酶抑制剂 (SMKI) 是一类靶向癌症等疾病中的蛋白激酶的治疗药物。SMKI 通常旨在抑制参与细胞增殖的激酶，但这些药物会改变细胞代谢和生物体代谢的内分泌控制。糖尿病癌症患者的 SMKI 治疗表明，某些 SMKI 可改善血糖水平，并可减轻 1 型糖尿病 (T1D) 和 2 型糖尿病 (T2D) 的胰岛素依赖或糖尿病药物需求。某些 SMKI 可以保留功能性 β 细胞质量并增加胰岛素分泌或胰岛素敏感性。目前尚不清楚为什么不同的 SMKI 会对胰岛素和血糖产生相反的影响。由于 SMKI 的脱靶效应重叠，了解这些药物对 T1D 和 T2D 的治疗效果变得复杂。抑制目标蛋白激酶和抑制多种脱靶激酶的效力可能是某些 SMKI 如何改变血糖和胰岛素的相互矛盾的报道的基础。我们总结了 SMKI 对可改变血糖和胰岛素的目标激酶和脱靶激酶的影响，包括 c-Abl、c-Kit、EGFR 和 VEGF。抑制 PDGFR β 可持续降低 1 型糖尿病和 2 型糖尿病患者的血糖。SMKI 对调节免疫通路的激酶（如 BTK 和 RIPK）的影响介导了这些药物对代谢的许多不同影响。我们强调，SMKI 对 RIPK2 的抑制是代谢的中心节点，影响脂肪分解、血糖控制、胰岛素分泌和胰岛素抵抗等关键代谢通路。
快速发展的基于 CRISPR/Cas 的基因组编辑
基因组编辑中有两个主要部分是实现精确遗传改变所必需的：用于靶标结合的定位部分和用于遗传工程的效应部分。利用 CRISPR/Cas（由用于独立靶标结合和切割的不同模块组成），已经开发出一系列精确且多功能的基因组编辑技术，广泛应用于生物医学研究、生物技术和治疗学。本文，我们从定位部分和效应部分的角度简要总结了基因组编辑系统的进展，并重点介绍了新报道的 CRISPR 结合碱基编辑和主要编辑系统的进展。我们还强调了 CRISPR 结合系统中脱靶效应的不同机制，并进一步讨论了未来减少脱靶突变的可能策略。
利用基因组编辑技术的基因治疗产品的质量及质量保证……
为了表征基因组编辑产品的脱靶效应，不仅需要通过计算机分析预测与目标基因序列相似序列的存在，还需要使用实验方法来分析整个人类基因组中潜在的脱靶位点[32-35]。寻找候选脱靶位点的实验方法包括在基因组编辑过程中在切割位点引入合成 DNA 标签，并在整个基因组中分析该标签的掺入情况的方法（GUIDE-seq）[36]，以及 DIGENOME-seq [37, 38]、CIRCLE-seq [39] 和 SITE-seq [40] 等方法，它们使用从细胞中提取的基因组来寻找基因组编辑酶可能的切割位点。这些分析可能包括识别癌症相关基因中的单核苷酸变异 (SNV)/插入和缺失 (Indel) 和拷贝数变异 (CNV) 等突变[41]。通过计算机分析和实验方法检测到的脱靶候选位点是否确实发生了切割或缺失的潜在方法包括对经过基因组编辑的细胞进行全基因组测序（WGS）[33, 35] 和扩增子测序，通过 PCR 扩增候选位点并进行深度测序 [42]。在这些分析中，检测灵敏度取决于碱基序列的读取深度。但是，由于新一代测序（NGS）的错误频率，检测脱靶效应非常困难，其发生频率低于0.1％（表1）。
CRISPR/Cas 基因组编辑的计算工具和资源
摘要 过去十年，人们在识别用途更广泛的成簇规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 (Cas) 核酸酶及其功能变体以及开发精确的 CRISPR/Cas 衍生基因组编辑器方面取得了快速发展。基因组编辑器的可编程和强大特性为基础生命科学研究及其在生物医学创新和有针对性的作物改良等不同场景中的后续应用提供了有效的 RNA 引导平台。最重要的原则之一是以预期的方式引导基因组序列或基因的改变，而不会产生不良的脱靶影响，这在很大程度上取决于单向导 RNA (sgRNA) 指导的识别目标 DNA 序列的效率和特异性。经验评分算法和机器学习模型的最新进展促进了 sgRNA 设计和脱靶预测。在本综述中，我们首先简要介绍了 CRISPR/Cas 工具的不同特点，应考虑到这些特点以实现特定目的。其次，我们重点介绍在设计 sgRNA 和分析 CRISPR/Cas 诱导的靶向和脱靶突变中广泛使用的计算机辅助工具和资源。第三，我们对现有计算工具的局限性提供了见解，这将有助于该领域的研究人员进一步优化。最后，我们提出了一个简单但有效的工作流程，用于选择和应用基于网络的 CRISPR/Cas 基因组编辑资源和工具。
比较三种不同递送方法在菊苣中实现 CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑。
菊苣根 ( Cichorium intybus L. var. sativum ) 用于提取菊粉，菊粉是一种用作天然甜味剂和益生元的果糖聚合物。然而，在菊粉提取过程中需要去除味道苦涩的倍半萜内酯，而菊苣正是因为这种内酯才具有其独特的风味。为了避免这种提取过程及其相关成本，最近通过灭活四个拷贝的 germacrene A 合酶基因 ( CiGAS-S1、-S2、-S3、-L )，创建了倍半萜内酯含量较低的菊苣变种，该基因编码的酶可启动菊苣中苦味倍半萜内酯的生物合成。在本研究中，对 CRISPR/Cas9 试剂的不同递送方法进行了比较，比较了它们在 CiGAS 基因中诱导突变的效率、脱靶突变的频率以及它们对环境和经济的影响。 CRISPR/Cas9 试剂通过农杆菌介导的稳定转化或使用相同 sgRNA 的质粒或预组装核糖核酸复合物 (RNP) 瞬时递送。所有使用的方法都会导致 CiGAS -S1 和 CiGAS -S2 基因中出现大量 INDEL 突变，这些基因与所用的 sgRNA 完全匹配；此外，与 sgRNA 有一个错配的 CiGAS -S3 和 CiGAS -L 基因也发生了突变，但突变效率较低。虽然使用 RNP 和质粒递送会导致双等位基因、杂合或纯合突变，但质粒递送会导致 30% 的质粒片段在基因组中不必要地整合。通过农杆菌转化的植物通常表现出嵌合现象和 CiGAS 基因型的混合。当植物生长较长时间时，这种基因镶嵌变得更加多样化。虽然瞬时和稳定递送方法中靶基因型各不相同，但在六种已识别的潜在脱靶中未发现脱靶活性，这些脱靶存在两到四个错配。这些方法对环境的影响（温室气体 (GHG) 排放和一次能源需求）在很大程度上取决于它们各自的电力需求。从经济角度来看 - 就像大多数研究和开发一样
EBT-101 在接受稳定 ART 治疗的 HIV-1 感染成人患者中开展的首次人体研究
通过完整的前病毒 DNA 检测 (IPDA) 评估潜伏 HIV 病毒库 病毒反弹时间：第 12 周分析治疗中断 [ATI] 内停用 ART 监测：切割/重组位点分析脱靶活性 (CRSA)
一种通用且快速的 CRISPR 脱靶位点检测工具
背景：II 型成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 是一种强大的基因组编辑技术，在基因功能分析中越来越受欢迎。在 CRISPR/Cas 中，RNA 引导 Cas 核酸酶到靶位点进行 DNA 修饰。结果：CRISPR/Cas 的性能取决于精心设计的单向导 RNA (sgRNA)。然而，sgRNA 的脱靶效应会导致基因组中出现不良突变，从而限制了 CRISPR/Cas 的使用。在此，我们介绍了一种通用且快速的 CRISPR 脱靶检测工具 OffScan。结论：OffScan 不受错配数量的限制，并允许自定义原型间隔区相邻基序 (PAM)，这是 Cas 蛋白的靶位点。此外，OffScan 采用 FM 索引，可有效提高查询速度并减少内存消耗。
Pegrna Infographic
Prime编辑是一种“搜索和替换”基因编辑技术，可提供更精确的编辑，而无需产生双链断裂，从而降低了脱靶效应的风险，并使其成为基因和细胞疗法的CRISPR/CAS9的潜在更安全的替代品。
预测使用机器学习靶向定位的CRISPR-CAS12A指南
通过开发CRISPR（定期间隔的短质体重复重复）的基因组编辑 - CAS技术彻底改变了生物学领域的许多领域。超过Cas9核酸酶，Cas12a（以前是CPF1）已成为CAS9编辑富含基因组的有希望的替代方法。尽管有承诺，但通过计算工具搜索指导RNA效率预测仍然缺乏准确性。通过计算元分析，我们报告说CAS12A靶标和脱靶裂解行为是核苷酸偏置的因素，相对于原始的邻接基序（PAM）相对于核苷酸不匹配。这些功能有助于训练一个随机的森林机器学习模型，以将准确性提高至少15％，而不是现有算法，以预测CAS12A酶的指导RNA效率。尽管有进展，但我们的报告强调了对更多代表性数据集的需求，并进一步进行基准测试，以可靠，准确地预测CAS12A酶的RNA效率和脱靶效应。