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SEMM：体细胞工程小鼠模型。一种用于基础和转化研究的体内疾病建模的新工具
尽管经过多年的临床前测试，大多数实验性肿瘤疗法在临床开发过程中都失败了。这就引出了一个问题：目前用于评估肿瘤疗法的临床前模型是否充分反映了患者的异质性和对治疗的反应。大多数临床前工作都是基于异种移植模型，其中肿瘤错误定位和缺乏免疫系统是将许多观察结果从临床前模型转化为患者的主要限制因素。基因工程小鼠模型 (GEMM) 具有更准确地重现疾病模型的巨大潜力，但其成本和复杂性阻碍了它们在发现、早期或晚期药物筛选计划中的广泛应用。由于 CRISPR/Cas9 系统的发现和开发，基因组编辑技术的最新进展为通过直接突变感兴趣的器官或组织区室中的体细胞基因组来生成与疾病相关的动物模型提供了机会。 CRISPR/Cas9 的出现不仅有助于生产传统的 GEMM，而且还使得人们能够绕过这些昂贵的菌株的构建。在这篇综述中，我们将体细胞工程小鼠模型 (SEMM) 描述为一种新的模型类别，其中特定的致癌特征被引入出生后动物的目标器官的体细胞中。此外，SEMM 代表了一种进行体内功能基因组学研究的新平台，这里将其定义为 DIVoS（直接体内筛选）。
肿瘤特异性 GPX4 降解增强铁死亡......
脂质过氧化依赖性铁死亡已成为一种新兴的肿瘤治疗策略。然而，目前的策略不仅选择性地诱导恶性细胞中的铁死亡，而且还同时触发免疫细胞中的铁死亡，这可能会损害抗肿瘤免疫力。在这里，我们使用 In-Cell Western 检测结合无偏药物筛选，确定化合物 N6F11 是一种铁死亡诱导剂，可触发谷胱甘肽过氧化物酶 4 (GPX4)（一种关键的铁死亡抑制剂）的降解，特别是在癌细胞中。N6F11 不会导致免疫细胞（包括树突状细胞、T 细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞）中的 GPX4 降解。从机制上讲，N6F11 与癌细胞中 E3 泛素连接酶三联基序 25 (TRIM25) 的 RING 结构域结合，从而触发 TRIM25 介导的 K48 连接 GPX4 泛素化，导致其蛋白酶体降解。从功能上讲，N6F11 治疗导致铁死亡癌细胞死亡，从而启动由 CD8 + T 细胞介导的 HMGB1 依赖性抗肿瘤免疫。N6F11 还增强了晚期癌症模型中针对 CD274/PD-L1 的免疫检查点阻断，包括由 KRAS 和 TP53 突变驱动的胰腺癌基因工程小鼠模型。这些发现可能建立一种安全有效的策略来增强铁死亡驱动的抗肿瘤免疫。
癌症是一种由致癌基因和肿瘤抑制基因突变引起的多因素疾病，导致细胞增殖失控和对细胞死亡产生抵抗力。癌症的发展是由于改变的细胞逃避免疫监视，而肿瘤与其微环境的相互作用促进了这种逃避。因此，了解逃避免疫监视的机制和肿瘤微环境的重要性可能有助于开发更好的治疗方法。虽然通常使用体内模型，但它们在时间、成本和道德方面可能更好。因此，复制体内模型并重建细胞和组织水平的功能至关重要。3D 细胞培养是一种合适的模型，它具有与体内相似的 3D 结构。此外，可以共培养多种细胞类型，从而建立 TME 和肿瘤细胞之间的细胞相互作用。此外，微流体灌注可以提供精确的流速，从而模拟组织/器官功能。免疫疗法可以与灌注 3D 细胞培养技术一起使用，以帮助开发成功的治疗方法。采用纳米递送的免疫疗法可以靶向该点并沉默负责基因，确保治疗效果，同时最大限度地减少副作用。本研究重点关注 3D 细胞培养在了解 3D 肿瘤和 TME 的病理生理学、TME 在药物耐药性、肿瘤进展中的作用以及开发用于高通量药物筛选的先进抗癌疗法方面的重要性。
文章使用镰状细胞病和健康供体诱导的多能干细胞对 2D 和 3D 红细胞分化方案进行评估
摘要：背景：镰状细胞病 (SCD) 是一种由 HBB 基因点突变引起的高度流行的遗传性疾病，可导致慢性溶血性贫血和血管闭塞事件。患者来源的诱导性多能干细胞 (iPSC) 有望为开发具有抗镰状细胞活性的药物筛选新预测方法带来希望。在本研究中，我们评估并比较了使用健康对照和 SCD-iPSC 的 2D 和 3D 红细胞分化方案的效率。方法：对 iPSC 进行造血祖细胞 (HSPC) 诱导、红细胞祖细胞诱导和终末红细胞成熟。通过流式细胞术分析、菌落形成单位 (CFU) 测定、形态学分析和基于 qPCR 的 HBB 和 HBG2 基因表达分析来确认分化效率。结果：2D 和 3D 分化方案均诱导了 CD34 + /CD43 + HSPC。3D 方案对 HSPC 诱导表现出良好的效率 (>50%) 和高生产率 (45 倍)，并增加了 BFU-E、CFU-E、CFU-GM 和 CFU-GEMM 集落的频率。我们还产生了 CD71 + /CD235a + 细胞 (>65%)，与 3D 方案开始时相比，细胞扩增了 630 倍。红细胞成熟后，我们观察到 95% 的 CD235a + /DRAQ5- 去核细胞、正染色性红细胞，以及与成人 HBB 相比胎儿 HBG2 表达增加。结论：使用 SCD-iPSC 和比较分析确定了一种用于红细胞分化的稳健 3D 方案；然而，成熟步骤仍然具有挑战性，需要进一步开发。
具有自归位纳米结构的癌症患者组织样体......
当前的癌症医学模式侧重于针对患者和/或癌症的治疗，这推动了患者代表（例如类器官）和用于药物筛选的癌症靶向载体的开发不断取得进展。作为突破性概念，i）活癌组织传达完整的患者特异性微环境特征。ii）可以利用具有强烈细胞间相互作用的癌块生长机制，通过使用癌细胞衍生的纳米囊泡 (CaNV) 来开发自归位纳米靶向。因此，通过在 3D 凝胶芯片中培养 OC 患者组织来开发卵巢癌 (OC) 的组织样模型，其微通道网络能够进行灌注以维持组织活力。通过将 OC 组织样异种移植到裸鼠缺血后肢中，可以建立一种新型全身癌症反应模型。 CaNV 用于携带一般化疗药物或针对 BRCA 突变或能量代谢的临床前/临床研究的新药，从而扩大了测试范围。这项开创性研究通过展示药物类型特异性效率、BRCA 突变依赖性药物效率和基于代谢抑制的抗癌效果结果的一致性，交叉验证了 OC 诊所、组织样和动物模型的药物反应。因此，这项研究为加速发现具有 CaNV 应用的患者特异性药物提供了方向性基础，以实现未来的精准医疗。
免疫肿瘤药物疗效评估的体外试验和个性化癌症治疗的筛选：范围和挑战
摘要 简介：免疫疗法彻底改变了癌症治疗，但往往无法在所有患者中产生理想的治疗效果。由于患者之间的异质性和肿瘤微环境的复杂性，个性化治疗方法的需求日益增长。长期以来，研究人员一直在使用一系列体外检测方法，包括 2D 模型、类器官共培养和癌症芯片平台进行癌症药物筛选。为了实现最佳转化使用，需要对这些检测方法的适用性、高通量能力和临床可转化性进行比较分析。涵盖的领域：该综述总结了体外平台的比较优势和局限性，包括构建策略和免疫肿瘤药物疗效评估的转化潜力。我们还讨论了终点分析策略，以便研究人员能够将其实用性情境化，并优化设计实验以预测个性化免疫疗法疗效。专家意见：研究人员开发了几种体外平台，可以从不同角度提供有关个性化免疫疗法疗效的信息。毫无疑问，基于图像的检测更适合收集包括细胞形态和表型行为在内的广泛信息，但需要进行重大改进以克服背景噪音、样品制备困难和实验时间长等问题。需要进行更多研究和临床试验来解决这些问题并验证检测方法，然后才能将其用于实际场景。
谷氨酸作用于酸性离子通道，导致缺血性脑损伤
谷氨酸传统上被视为第一个激活NMDAR（N-甲基-D-天冬氨酸受体）依赖性细胞死亡途径1,2中的细胞死亡途径，但使用NMDAR拮抗剂进行了不成功的临床试验，暗示了其他机制3-7的参与。在这里，我们表明谷氨酸及其结构类似物，包括NMDAR拮抗剂L-AP5（也称为APV），通过与酸中毒诱导的中风中神经毒性相关的酸性离子通道（ASICS）介导的稳健性电流4。谷氨酸增加了ASIC对质子的亲和力及其开放概率，从而在体外和体内模型中加剧了缺血性神经毒性。定向诱变，基于结构的建模和功能测定法显示ASIC1A外细胞外结构域中的真正的谷氨酸结合腔。计算药物筛选确定了一个小分子LK-2，该分子与该空腔结合并废除了ASIC电流的谷氨酸依赖性增强，但避免了NMDARS。lk-2减少了缺血性中风的小鼠模型中的梗塞体积并改善了感觉运动恢复，让人联想到在ASIC1A敲除或其他阳离子通道4-7的小鼠中看到的。我们得出的结论是，谷氨酸是ASIC的阳性变构调节剂，以加剧神经毒性，并优先针对NMDARS上的ASIC上的谷氨酸结合位点靶向，以开发NMDAR Antagonist的精神病性副作用，以开发中风治疗。
使用人类诱导性多能干细胞衍生的多细胞心脏类器官模拟急性心肌梗死和心脏纤维化
心脏病涉及不可逆的心肌损伤，导致高发病率和死亡率。许多基于细胞的心脏体外模型已被提出作为非临床动物研究的补充方法。然而，大多数这些方法都难以准确复制成人心脏状况，例如心肌梗死和心室重塑病理。成人心脏内各种细胞类型（包括心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞）之间的复杂相互作用增加了大多数心脏病的复杂性。因此，心脏病诱发的机制不能归因于单细胞类型。因此，使用多细胞模型对于创建临床相关的体外细胞模型至关重要。本研究重点是使用人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 生成自组织心脏类器官 (HO)。这些类器官由心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞组成，模仿人类心脏的细胞组成。通过各种技术确认了 HO 的多细胞组成，包括免疫组织化学、流式细胞术、q-PCR 和单细胞 RNA 测序。随后，在受控培养条件下对 HO 进行缺氧诱导的缺血和缺血-再灌注 (IR) 损伤。产生的表型类似于急性心肌梗死 (AMI)，其特征是心脏细胞死亡、生物标志物分泌、功能缺陷、钙离子处理改变和搏动特性改变。此外，受到 IR 的 HO 有效地表现出心脏纤维化，显示胶原沉积、钙离子处理中断和模拟心脏病的电生理异常。这些发现对于体内 3D 心脏和疾病建模的进步具有重要意义。这些疾病模型为研究心脏疾病的动物实验提供了一种有希望的替代方案，并且它们也可作为药物筛选的平台以确定潜在的治疗靶点。
化学生物学和药物化学
我们的项目在年轻和经验丰富的教授的均衡组合下，已成为化学生物学和学术药物发现领域的全球领导者。我们的杰出教授包括 Bryan Roth 博士、David Lawrence 博士、Stephen Frye 博士、Jian Liu 博士、Jeff Aubé 博士、Alex Tropsha 博士和 KH Lee 博士。Roth 是国际公认的精神活性药物筛选项目的首席研究员。Lawrence 的工作重点是用光控制异常和正常的细胞行为。作为葛兰素史克公司前全球发现药物化学负责人，Frye 指导学院的综合化学生物学和药物发现中心，并领导北卡罗莱纳州综合化学生物学中心。刘的研究团队专注于糖生物学及其治疗应用。Aubé 在有机化学方面的重点包括有机合成方法，尤其关注生物碱。 Tropsha 是计算化学、化学信息学和结构生物信息学领域的专家，开发了用于计算机辅助药物设计的新方法和软件工具。Lee 是美国药学院协会 Volwiler 研究成就奖的获得者，发表了 800 多篇研究论文，并领导一个团队发现了数千种具有生物活性的天然产物。我们的高级教师还包括研究生招生主任 Drew Lee 教授，他为专业和研究生教学任务做出了贡献，而他的研究重点是从物理结构生物学的角度加强对蛋白质功能的理解。
斑马鱼肿瘤异种移植模型的优势
在目前的临床前抗肿瘤研究中，普遍缺乏能够快速高效筛选有效抗肿瘤药物的体内模型。斑马鱼作为与人类基因相似度高达 87% 的物种，已被广泛用于模拟人类疾病，被认为是研究癌症发展、增殖和转移的替代经济模型。斑马鱼肿瘤异种移植模型已被有效用于各个层面的癌症药物开发，包括靶标验证和可能参与肿瘤调控的长链非编码 RNA (lncRNA) 的高通量筛选。在这篇综述中，我们全面概述了斑马鱼作为癌细胞生长、迁移、抗肿瘤免疫治疗和抗肿瘤药物筛选的体内模型。此外，一些活性 lncRNA 的调控机制已被确定在癌症的发病机制中发挥作用，但仍有必要利用高效的斑马鱼模型来筛选和进一步了解这些分子在肿瘤发展和迁移中的作用。目前的抗肿瘤疗法受到严重毒性和多药耐药性的限制。迫切需要经济高效的体内研究工具来提高我们的理解并克服这些问题。本文综述了使用斑马鱼模型进行抗肿瘤研究的不同目的。我们讨论了斑马鱼在癌细胞增殖和转移、识别信号通路、癌症药物发现和治疗开发以及毒性研究中的应用。最后，本综述强调了该领域的局限性和未来方向，以有效利用斑马鱼作为癌症治疗开发的高效模型。