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CRISPR-CAS效应子的特异性和裂解位点确定噬菌体逃脱结果
au：PleaseconfirnheadingLevelsarerePresentedCorrected：CRISPR介导的干扰依赖于指导性CRISPR RNA（CRRNA）和靶核酸之间的互补性，以提供防御噬菌体的防御。噬菌体逃脱了基于CRISPR的免疫力，主要是通过邻接基序（PAM）和种子区域中的突变。然而，包括2类核酸内切酶Cas12a在内的CAS效应子的先前特异性研究表明，单个不匹配的耐受性很高。在噬菌体防御的背景下，尚未对这种不匹配公差的效果进行广泛的研究。在这里，我们测试了针对由Cas12a-CrrNA提供的lambda噬菌体的防御，该噬菌体含有含有先前存在的对基因组DNA中基因组靶标的不匹配。我们发现大多数先前存在的crrna不匹配导致噬菌体逃脱，无论在体外是否不匹配消融cas12a裂解。我们使用高通量测序来检查CRISPR挑战后噬菌体基因组的目标区域。在目标中的所有位置的不匹配均加速了突变噬菌体的出现，其中包括不匹配的不匹配，这些不匹配大大减慢了体外的裂解。出乎意料的是，我们的结果表明，PAM距离区域中存在的错误匹配导致目标的PAM-DISTAL区域中选择突变。体外裂解和噬菌体竞争分析表明，双Pam-Distal错误匹配比种子和Pam-Distal mis-grountes的组合要高得多，从而导致了这种选择。这些结果表明，CAS效应不匹配的耐受性，现有的靶标匹配和裂解位点强烈影响噬菌体的演变。但是，使用CAS9的类似实验并未导致PAM-DISTAL不匹配的出现，这表明切割位置的位置和随后的DNA修复可能会影响目标区域内逃生突变的位置。多种不匹配的CRRNA的表达阻止了新的突变在多个靶向位置产生，从而允许CAS12A不匹配的耐受性提供更强，更长期的protection。
CAS12A R环的结构基础在DNA裂解途径上
（未通过同行评审认证）是作者/资助者。保留所有权利。未经许可就不允许重复使用。此预印本版的版权持有人于2023年3月13日发布。 https://doi.org/10.1101/2023.03.13.13.532460 doi：Biorxiv Preprint
RDD-HCD 提供由自由基稳定性决定的可变裂解路线
摘要：自由基定向解离 (RDD) 是一种碎裂技术，其中通过选择性 213/266 nm 光解离碳 − 碘键产生的自由基被重新分离并碰撞活化。在之前的 RDD 实验中，碰撞活化是由离子阱碰撞诱导解离 (CID) 实现的。高能碰撞解离 (HCD) 与 CID 的不同之处在于离子的激发方式以及观察到的碎片的数量、类型或丰度。在本文中，我们探讨了 HCD 在 RDD 实验中的活化用途。尽管无论采用何种活化能，RDD-CID 都有利于由自由基定向途径（例如 a/z 离子和侧链损失）产生的碎片，但 RDD-HCD 光谱随活化能的变化而变化很大，较低的能量有利于 RDD，而较高的能量有利于由移动质子（b/y 离子）引导的裂解产生的产物。因此，RDD-HCD 可以根据提供的 HCD 能量提供更可调的碎片。重要的是，随着 HCD 能量的增加，自由基产物的丰度会降低，这证实了 RDD 通常通过较低能量屏障进行，而不是通过移动质子驱动的解离。因此，对于 RDD-HCD，b/y 离子在较高能量下占主导地位可以通过在初始或后续解离事件后不含自由基的碎片的更高存活率来解释。此外，这些结果证实了先前的猜测，即由于多次解离事件，HCD 光谱与 CID 光谱不同。关键词：碎片化、光解离、自由基定向解离、高能碰撞解离、碰撞诱导解离■ 简介
裂解靠近DNA片段的末端（线性化矢量）
应用Illumina的Nebnext Ulta DNA库准备套件包含酶和缓冲液，是将少量DNA输入转换为Illumina Platform（Illumina，Inc）上下一代测序的索引库的理想选择。Nebnext Ultra DNA库的工作流程的Illumina的Prep套件非常友好且快速，动手的时间很少。这些组件中的每一个都必须通过严格的质量控制标准，并且无论是单独还是作为一组试剂。
嗜热菌 Cas9 的 HNH 核酸酶中静电接触的破坏会重新连接变构运动并增强高温 DNA 裂解
多结构域蛋白内的变构信号传导是空间上相距较远的功能位点之间通信的驱动因素。了解大型多结构域蛋白中变构耦合的机制是实现系统空间和时间控制的最有希望的途径。最近，CRISPR-Cas9 在分子生物学和医学领域的应用激增，这促使人们需要了解 Cas9 的原子级蛋白质动力学（这是其变构串扰的驱动力）如何影响其生物物理特性。在本研究中，我们使用核磁共振 (NMR) 和计算的协同方法来精确定位热稳定性 Geo Cas9 的 HNH 结构域中的变构热点。我们表明，K597 突变为丙氨酸会破坏盐桥网络，进而改变 Geo HNH 结构域的结构、变构运动的时间尺度和热稳定性。在广泛研究的中温 S. pyogenes Cas9 中，这种同源赖氨酸到丙氨酸的突变同样改变了 Sp HNH 域的动力学。我们之前已经证明，通过突变改变变构是 Sp Cas9 (e Sp Cas9) 特异性增强的来源。因此，这在 Geo Cas9 中可能也是如此。由 AIP Publishing 独家授权发布。https://doi.org/10.1063/5.0128815
CAS12A的反式DNA裂解活性没有可检测到的免疫力对质粒或噬菌体
CAS12A是V-A型CRISPR-CAS RNA引导的内切酶。它在特定位点切割了dsDNA，然后在体外反式跨体内激活以非特征ssDNA的裂解。反式活性的免疫功能仍然未知。为了解决这个问题，我们在大肠杆菌中构建了一个CAS12A靶向系统，其中CAS12A裂解了高拷贝靶质粒以释放反式ssDNA裂解活性。然后，我们分析了Cas12a靶向对非目标质粒和ssDNA噬菌体的影响。结果表明，CAS12A有效地消除了目标质粒，但对噬菌体的非目标质粒或鼠疫形成的维持没有影响。此外，有助于靶质粒耗竭的两间隔crispr阵列仍然对非目标质粒或噬菌体没有可检测的影响。一起，数据表明CAS12A的反式ssDNA切割不会导致体内免疫力。
实时 PCR 检测猴痘病毒的方案 1 提取外部裂解 (LSB3)：200µl 样品 + 200µl 裂解缓冲液 (Qiagen QIAamp DNA mini kit) 内部控制：10µl SPCY 1/100。手动提取，洗脱量为 200µl。 QIAamp DNA 迷你试剂盒：编号：51304 批号：172023567 2 PCR 试剂盒名称：猴痘病毒 (MPV) DNA 检测试剂盒（冻干）制造商：广东华银医药科技有限公司供应商：Primadiag 标记：IVD 编号：HY06162 手册：？储存温度/30°C。批号：20220601 / 20240605 基质：血清/血浆、咽拭子、唾液、其他病变。目标荧光团激发发射猴痘FAM 495 nm 515 nm 内部控制VIC 538 nm 554 nm 3 条件热循环仪：BioRad OPUS96 参考：795BR03596 PCR 混合物体积：20µl DNA 体积：5µl 循环：
实时 PCR 检测猴痘病毒的方案 1 提取外部裂解 (LSB3)：200µl 样品 + 200µl 裂解缓冲液 (Qiagen QIAamp DNA mini kit) 内部控制：10µl SPCY 1/100。手动提取，洗脱量为 200µl。 QIAamp DNA 迷你试剂盒：编号：51304 批号：172023567 2 PCR 试剂盒名称：猴痘病毒 (MPV) DNA 检测试剂盒（冻干）制造商：广东华银医药科技有限公司供应商：Primadiag 标记：IVD 编号：HY06162 手册：？储存温度/30°C。批号：20220601 / 20240605 基质：血清/血浆、咽拭子、唾液、其他病变。目标荧光团激发发射猴痘FAM 495 nm 515 nm 内部控制VIC 538 nm 554 nm 3 条件热循环仪：BioRad OPUS96 参考：795BR03596 PCR 混合物体积：20µl DNA 体积：5µl 循环：
肠道微生物靶向胆碱三甲胺裂解酶...
摘要 肥胖一直与肠道微生物群的重组有关，但到目前为止，肥胖治疗仅针对人类宿主。在这里，我们表明，针对肠道微生物抑制三甲胺 N-氧化物 (TMAO) 通路可保护小鼠免受与饮食引起的肥胖 (DIO) 或瘦素缺乏 (Lep ob/ob) 相关的代谢紊乱。肠道微生物酶胆碱 TMA-裂解酶 (CutC) 的小分子抑制不会减少食物摄入量，而是与肠道微生物群的改变、葡萄糖耐受性的改善和能量消耗的增加有关。我们还表明，肠道微生物 CutC 抑制与宿主对磷脂酰胆碱和能量代谢的昼夜节律控制的重组有关。这项研究强调了微生物与宿主代谢之间的关系，并提供了肠道微生物衍生的三甲胺 (TMA) 是宿主昼夜节律时钟的关键调节器的证据。这项研究还表明，针对肠道微生物的酶抑制剂具有作为抗肥胖疗法的潜力。
