Invitrogen™TRUECUT™Cas9蛋白用于使用CRISPR技术的基因组编辑应用。cas9蛋白与CRISPR-CAS9系统的引导RNA(GRNA)成分形成非常稳定的核糖核蛋白(RNP)复合物。纳入核定位信号(NLS)的掺入有助于其向细胞核的传递,从而增加了基因组DNA裂解的速率。与质粒系统相比,它可以迅速清除,从而最大程度地减少了脱靶裂解的机会(Liang等,2015)。与基于质粒的CRISPR系统相比,CAS9核酸酶已在多种悬浮液和粘附细胞系中进行了测试,并且显示出优异的基因组裂解效率和细胞的生存能力。
试剂盒特异性:此检测试剂盒含有可识别 AXIN-2 上不同表位的抗体。此试剂盒检测的蛋白质对应于 UniProt ID Q9Y2T1。AXIN-2 也称为轴蛋白样蛋白 (Axil)、轴抑制蛋白 2 和 Conductin。这些抗体可识别人类来源的 AXIN-2。其他物种应根据具体情况进行测试。对照裂解物信息:阳性对照裂解物:由 SW 48 细胞制备,在含有 10% FBS 的培养基中在 T175 烧瓶中培养至汇合,并用 2.5 mL 裂解缓冲液裂解。代表性数据:使用 2 板 2 孵育方案获得的数据。将 SW 48 细胞以 40K 细胞/孔接种在 96 孔板中并孵育过夜。用指定浓度的 Tankyrase 抑制剂 (XAV-939) 处理细胞 24 小时。使用裂解缓冲液裂解细胞,然后使用相应的 SureFire Ultra 试剂盒分别测定 AXIN-2 Total 和 ERK1/2 Total。相当于约 4,000 个细胞/数据点。
作为 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术的核心,内切酶 Cas9 可在 DNA 中引入位点特异性断裂。然而,目前仍缺乏改善 Cas9 功能的精确机制信息。本文将多微秒分子动力学、自由能和多尺度模拟与溶液 NMR 和 DNA 裂解实验相结合,以解析靶 DNA 裂解的催化机制。我们表明,活性 HNH 核酸酶的构象与催化 Mg 2+ 紧密相关,揭示了其主要的结构作用。这种活性 Mg 2+ 结合的 HNH 通过分子模拟、溶液 NMR 和 DNA 裂解分析得到一致描述,同时还揭示了催化 H840 的质子化状态受到活性位点突变的强烈影响。最后,从头算 QM(DFT)/MM 模拟和元动力学建立了催化机制,表明催化作用由 H840 激活并由 K866 完成,从而使 DNA 裂解实验合理化。这些信息对于增强 CRISPR-Cas9 的酶功能以改进基因组编辑至关重要。
在(S1)位点通过PC5/Furin糖基化和蛋白水解裂解后,成熟的缺口受体是在(S1)位点产生的,并作为异二聚体靶向细胞表面。Notch通过与相邻细胞提出的配体结合而激活。配体内吞作用会产生机械力,以促进结合凹槽受体的构象变化。这种构象变化使Adam Melallalloteases的裂解中的位点S2暴露了S2。juxtamembrane Notch裂解会产生下一个片段,该片段由γ-分泌酶配合物裂解以释放缺口细胞内结构域(NICD)和Nβ肽。nicd进入核与DNA结合蛋白CSL(脊椎动物中的CBF1/RBPJK)相关的细胞核。共激活因子策划者(MAM)识别NICD/CSL界面,该三蛋白复合物募集了其他共激活因子以激活转录。在没有NICD的情况下,CSL可能与无处不在的核心核心(CO-R)和HDAC相关联,以抑制靶基因的转录。
使用特殊配方的缓冲液MB1和裂解矩阵E与MP BioMedicals的FastPrep®仪器结合使用,可以在几秒钟内实现各种样品的有效裂解。在套件中提供的列MB和套件缓冲液旨在提供高产量和纯度的GDNA,并与QPCR,限制消化和测序等下游应用兼容。
包括天然产物,肽和合成小型化合物在内的各种分子通过与靶向生物大分子的特定相互作用表现出其生物学活性。蛋白质在内,包括酶,受体和离子通道代表这些靶标的主要群体。鉴定与生物活性配体相互作用的未知蛋白靶标在化学生物学和药物发育领域已经是必不可少的。但是,这种研究方法是耗时且费力的。靶标识别包括一系列过程:(1)使用具有生物活性配体作为诱饵的靶标的靶; (2)钩靶的富集; (3)通过Edman退化或质谱法(MS)对目标进行序列分析。1对于第一步,照片 - 亲和力标记允许在光辐射时将诱饵共价为相应的目标,因为可能适用于低亲和力配体靶向对。1a,b,2然后将钩状靶标与生物素链接蛋白珠相互纯化的生物素化接头分子使用生物素 - 链霉亲蛋白相互作用链接。1,3
摘要:抗体-药物偶联物 (ADC) 是一种快速兴起的治疗平台。抗体和药物有效载荷之间的化学接头在这些药物的功效和耐受性中起着至关重要的作用。定量评估复杂组织环境中的裂解效率的新方法可以为 ADC 设计过程提供有价值的见解。在这里,我们报告了一种近红外 (NIR) 光学成像方法的开发,该方法可以测量小鼠模型中接头裂解的位置和程度。这种方法是由我们最近设计的花青氨基甲酸酯 (CyBam) 平台的优越变体实现的。我们发现了一种新型的含叔胺的去青花青,这是 CyBam 裂解的产物,由于细胞通透性和溶酶体积累的改善,其细胞信号显著增加。由此产生的花青溶酶体靶向氨基甲酸酯 (CyLBams) 在细胞中的亮度约为 50 倍,我们发现这种策略对于高对比度体内靶向成像至关重要。最后,我们在两种抗体和肿瘤模型中比较了几种常见的 ADC 接头。这些研究表明,蛋白酶可裂解接头比受阻或不受阻的二硫键具有更高的肿瘤活化作用 - 这一观察结果只有在体内成像中才能明显看出。该策略可以定量比较复杂组织环境中的可裂解接头化学性质,对整个药物递送领域都有影响。
• 蒸汽裂解装置 (SCU)、• 苯乙烯萃取 (SE)、• 裂解汽油加氢处理装置 (PGH)、• 环氧乙烷和乙二醇 (TEiG)、• ETBE 装置 (ETBE)、• 冷却水装置 (Instalacja chłodzenia wody obiegowej, CW)、• 蒸汽发生器 (SGU)、• 冷凝水处理装置 (CTU)。以及变电站建筑、电气和控制室。(Hyundai Engineering &Tecnicas Reunidas)
多药耐药细菌对公共卫生构成了重要的全球威胁,尤其是在严重的医院感染患者中。值得注意的是,由于它们与人类感染和抗生素耐药基因的转移,克雷伯氏菌和拉乌尔特省属引起了人们的关注。噬菌体疗法最近引起了人们的注意,作为治疗这些感染的一种新方法。但是,这种方法的效率依赖于具有广泛宿主范围的噬菌体。在这项研究中,使用肺炎克雷伯氏菌作为宿主,从河水样品中分离出具有较宽宿主范围的噬菌体K14-2。噬菌体的生物学特性的特征是评估其感染的多样性,杀死曲线,一步生长曲线以及跨不同pH水平和温度的稳定性。形态学分析表明,噬菌体非常类似于肌瘤病毒。宿主范围包括来自克雷伯氏菌,拉乌尔特氏菌和埃希里希氏菌的6种菌株。发现K14-2的基因组是双链DNA,包括175,759个碱基对,GC含量为41.8%。基因组注释揭示了280个蛋白质编码基因,其中96个分配了功能。与K14-2具有最高基因组相似性的噬菌体为vb_kpm-牛奶。基于主要衣壳蛋白建造的系统发育树发现噬菌体属于Straboviridae家族的Slopekvirus属。鉴于这些特征,新型噬菌体K14-2的发现具有广泛的宿主范围,具有增强噬菌体疗法在未来研究中的有效性的潜力。
化学交联能够快速识别 RNA-蛋白质和 RNA-核酸分子间和分子内相互作用。然而,目前尚无方法能够位点特异性和共价交联 RNA 内两个用户定义的位点。在这里,我们开发了 RNA-CLAMP,它能够位点特异性和酶促交联(夹紧)RNA 内两个选定的鸟嘌呤残基。分子内夹紧会破坏正常的 RNA 功能,而随后对交联剂进行光裂解会恢复活性。我们使用 RNA-CLAMP 通过光裂解交联剂夹紧 CRISPR-Cas9 基因编辑系统的单向导 RNA (sgRNA) 内的两个茎环,完全抑制编辑。可见光照射会裂解交联剂并以高时空分辨率恢复基因编辑。设计两种对不同波长的光有响应的光裂解接头,可以在哺乳动物细胞中实现基因编辑的多路复用光激活。这种光激活的 CRISPR-Cas9 基因编辑平台受益于无法检测的背景活动,提供激活波长的选择,并具有多路复用功能。