图 1:检测原理说明。血管紧张素 II 肽被 ACE2 裂解后释放出 L-苯丙氨酸,可通过两步反应和荧光产物检测进行测量。荧光信号与 ACE2 活性成正比增加。注意:如需更高灵敏度的检测,请参阅 Fluoro-Verse™ ACE2 抑制剂检测试剂盒 (#78847)。背景血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 是一种外肽酶,可催化血管紧张素 II 转化为血管紧张素 1-7 和 L-苯丙氨酸。血管紧张素 II 是经典肾素血管紧张素系统 (RAS) 的一部分,这是一种调节体液平衡、血压和维持血管张力的激素系统。ACE2 在降低血压和心血管健康方面发挥作用,因此是一个有吸引力的治疗靶点。 ACE2 也是人类呼吸道冠状病毒 NL63、SARS (SARS-CoV) 和 2019-nCoV/SARS- CoV-2 的受体。应用酶动力学和高通量筛选 (HTS) 应用中的小分子抑制剂筛选。提供的材料
图 1:PDE4C1 检测试剂盒原理图解。该检测使用荧光素标记的环状鸟苷酸(PDE4C1 为 cAMP-FAM),其中磷酸基团与环状核苷酸结合。这是一种旋转速度快(低 FP)的非常小的分子。PDE4C1 催化环状核苷酸中磷酸二酯键的水解并释放磷酸基团。在第二步中,游离磷酸基团被特定的磷酸结合纳米珠(结合剂)识别,从而形成大型复合物,运动受限(高 FP)。FP 与 PDE4C1 活性成正比。该检测需要荧光微孔板读数仪,该读数仪能够测量荧光偏振 (FP),并配备读取 FP 信号所需的部件。有关 FP 技术的更多信息,请访问我们的技术说明:FP、检测原理和应用。注意:截至 2025 年 1 月,此协议已重新优化性能。可根据要求提供此试剂盒的早期版本。背景磷酸二酯酶 (PDE) 通过水解第二信使 cAMP (环磷酸腺苷) 和 cGMP (环磷酸鸟苷) 信号,在动态调节这些信号传导中起重要作用。PDE 超家族由 11 个家族组成,其中 PDE4、7 和 8 是 cAMP 特异性水解酶,因此可调节对其的正向和负向反应。PDE4 是心血管组织中第二丰富的 PDE。PDE4 是一种 cAMP 特异性 PDE,也是最大的 PDE 亚家族,具有超过 35 种不同的同工型,因此也是特征最广泛的 PDE 同工酶。它是大多数炎症细胞和气道平滑肌中的主要同工酶,与炎症性气道疾病有关。PDE4 抑制剂罗氟司特已被批准用于治疗慢性阻塞性肺病 (COPD)。
4. 14,000 × g 离心 2 分钟,转移 500 ul 上清液到新的 2 ml 离心管,加入 500 μL Buffer AL 和 600 μL 异丙醇和 15 µL MB Mix ,室温
PANDNA试剂盒包含3个洗涤缓冲液(CW1,CW2和PW1),以提取各种样品类型。CBB套件仅包含2个洗涤缓冲液(CW1和CW2)。缓冲CW1,CW2和PW1作为浓缩物提供。CW1和CW2的最终乙醇浓度使用60%。PW1最终乙醇浓度使用70%。在使用之前,如瓶子上所示,将适当的乙醇量(96-100%)添加到缓冲液CW1,CW2和PW1中。注意:并非所有缓冲区都在每个过程中使用。
组分 24 次反应 48 次反应 P-2014-24 P-2014-48 CP1(洗涤缓冲液) 28 ml 2 x 28 ml CP2(抗体缓冲液) 15 ml 30 ml CP3C(5X 裂解缓冲液 I) 12 ml 24 ml CP3D(裂解缓冲液 II) 3 ml 6 ml CP3E(裂解缓冲液 III) 2 ml 4 ml CP3F(裂解缓冲液 IV) 1.5 ml 5 ml CP4(ChIP 稀释缓冲液) 2 ml 6 ml CP5(DNA 释放缓冲液) 2 ml 2 x 2 ml CP6(反向缓冲液) 2 ml 2 x 2 ml CP7(结合缓冲液) 5 ml 8 ml CP8(洗脱缓冲液) 0.6 ml 1.2 ml 蛋白酶抑制剂混合物 (100X)* 25 µl 50 µl 非免疫 IgG (1 mg/ml)* 10 µl 10 µl 抗二甲基 H3-K9 (1 mg/ml)* 5 µl 8 µl 蛋白酶 K (10 mg/ml)* 25 µl 50 µl 8 孔检测条(带框架) 3 6 8 孔条盖 3 6 F-Spin Column 30 50 F-Collection Tube 30 50 * 使用前将溶液旋至底部。 运输和储存
组分 24 次反应 48 次反应 P-2014-24 P-2014-48 CP1(洗涤缓冲液) 28 ml 2 x 28 ml CP2(抗体缓冲液) 15 ml 30 ml CP3C(5X 裂解缓冲液 I) 12 ml 24 ml CP3D(裂解缓冲液 II) 3 ml 6 ml CP3E(裂解缓冲液 III) 2 ml 4 ml CP3F(裂解缓冲液 IV) 1.5 ml 5 ml CP4(ChIP 稀释缓冲液) 2 ml 6 ml CP5(DNA 释放缓冲液) 2 ml 2 x 2 ml CP6(反向缓冲液) 2 ml 2 x 2 ml CP7(结合缓冲液) 5 ml 8 ml CP8(洗脱缓冲液) 0.6 ml 1.2 ml 蛋白酶抑制剂混合物 (100X)* 25 µl 50 µl 非免疫 IgG (1 mg/ml)* 10 µl 10 µl 抗二甲基 H3-K9 (1 mg/ml)* 5 µl 8 µl 蛋白酶 K (10 mg/ml)* 25 µl 50 µl 8 孔检测条(带框架) 3 6 8 孔条盖 3 6 F-Spin Column 30 50 F-Collection Tube 30 50 * 使用前将溶液旋至底部。 运输和储存
一氧化氮 (NO) 是许多生理过程的分子介质,包括血管舒张、炎症、血栓形成、免疫和神经传递。目前有许多方法可用于测量生物系统中的 NO。其中一种方法是使用 Griess 重氮化反应,通过分光光度法检测生理条件下 NO 自发氧化形成的亚硝酸盐。该方法的检测限为 1.0 µM 亚硝酸盐。Griess 反应还可用于通过硝酸盐催化还原为亚硝酸盐来分析硝酸盐。
该测试基于测量吞噬 FITC 标记大肠杆菌的细胞的荧光。将肝素化血液样本与荧光大肠杆菌混合,并在 37 °C 下孵育。使用不含大肠杆菌的阴性对照来设置吞噬细胞和非吞噬细胞之间的鉴别边界。通过反复清洗去除未吞噬的细菌。使用台盼蓝(一种不会穿透细胞膜的活体染料)淬灭任何剩余的细胞外或表面结合细菌。裂解红细胞,固定细胞,并用碘化丙啶染色 DNA,以区分有核细胞和细菌碎片或团块。测试中使用的大肠杆菌用人 AB 血浆调理,确保结果不主要取决于测试血液样本的调理活性。
试剂盒特异性:此检测试剂盒含有可识别 AXIN-2 上不同表位的抗体。此试剂盒检测的蛋白质对应于 UniProt ID Q9Y2T1。AXIN-2 也称为轴蛋白样蛋白 (Axil)、轴抑制蛋白 2 和 Conductin。这些抗体可识别人类来源的 AXIN-2。其他物种应根据具体情况进行测试。对照裂解物信息:阳性对照裂解物:由 SW 48 细胞制备,在含有 10% FBS 的培养基中在 T175 烧瓶中培养至汇合,并用 2.5 mL 裂解缓冲液裂解。代表性数据:使用 2 板 2 孵育方案获得的数据。将 SW 48 细胞以 40K 细胞/孔接种在 96 孔板中并孵育过夜。用指定浓度的 Tankyrase 抑制剂 (XAV-939) 处理细胞 24 小时。使用裂解缓冲液裂解细胞,然后使用相应的 SureFire Ultra 试剂盒分别测定 AXIN-2 Total 和 ERK1/2 Total。相当于约 4,000 个细胞/数据点。