XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search System靶位点
一种测定桦树和杨树中CRISPR/Cas系统切割效率的方法
摘要 测定Cas9对靶位点的切割效率对于基因组编辑非常重要。然而，这种测定只能通过体外方法进行，因为需要纯化Cas蛋白和合成gRNA。在这里，我们开发了一种体内方法，称为植物瞬时CRISPR/Cas编辑（TCEP）来测定Cas9的切割效率。按常规方法构建农杆菌介导的植物转化CRISPR/Cas载体。利用我们建立的瞬时转化方法，Cas9蛋白和gRNA瞬时表达并形成复合物以切割其靶位，从而导致动态DNA断裂。使用qPCR定量断裂的DNA以测量Cas9的切割效率。我们利用TCEP和体外方法研究了白桦和山杨×波利纳植物中Cas9对不同靶位点的切割效率。 TCEP法测定结果与体外法一致，说明TCEP法测定切割效率可靠。另外，利用TCEP法，我们发现热处理和超声处理均能显著提高CRISPR/Cas效率。因此，TCEP法具有广泛的应用价值，不仅可用于分析CRISPR/Cas效率，还可用于确定Cas9切割中涉及的因素。
堪萨斯州的抗咪唑疗法的施加乳肌（高粱双色L。）种群
Shattercane是产生谷物高粱的地区有问题的夏季一年草杂草物种。从堪萨斯州西北部的高粱田中收集的三个碎屑种群（DC8，GH4和PL8）幸存下来的现场使用率（52 g ha-1），这些率（52 g ha-1）被施加了imazamox。这项研究的主要目标是1）确认并表征了推定的抗胺氮杂（IMI-R）碎屑种群中对咪唑唑的抗性水平，2）研究耐药性的潜在机制，3）确定后孔剂的效果在升华后生物剂对控制IMI-R种群的有效性。使用了来自堪萨斯州鲁克斯县的先前已知的imazamox易感（SUS）碎片脉。与SUS人群相比，所有三个推定的人群对咪扎莫克斯的耐药性表现出4.1倍至6.0倍。来自所有IMI-R种群的ALS基因序列均未揭示任何已知的靶位点抗性突变。对马拉硫酮的预处理，它抑制细胞色素P450，其次是各种剂量的imazamox，逆转了PL8群体的耐药表型。在另一项温室研究中，使用尼克富龙，测quizalofop，clethodim和草甘膦的出现后处理导致所有IMI-R种群≥96％的损伤。缺乏已知的ALS靶位点突变和Malathion的抗药性表型的逆转表明，在PL8 Shattercane种群中，可能基于代谢对咪唑瘤的抗性。
简单、高效、开源的 CRISPR/Cas9 策略用于欧洲山杨多位点基因组编辑
尽管 CRISPR/Cas9 系统已成功用于作物育种，但其在林木中的应用仍然有限。本文，我们描述了一种基于 Golden Gate MoClo 克隆的杂交杨树（Populus tremula × alba INRA 克隆 717-1B4）的有效基因编辑策略。为了测试系统生成单基因突变体的效率，设计了两个单向导 RNA (sgRNA)，并将其与 Cas9 表达盒一起整合到 MoClo Tool Kit 2 级二元载体中，以突变 SHORT ROOT (SHR) 基因。此外，我们还通过表达一个针对 YUC4 基因单个位点的 sgRNA 和另一个针对 PLT1 基因的 sgRNA 来测试其同时在两个基因中引入突变的效率。为了对该方法进行稳健评估，我们重复了该策略，使用独立的构建体同时靶向 LBD12 和 LBD4 基因。我们通过农杆菌介导的叶片转化产生了毛状根。测序结果证实了 PtaSHR 靶位点发生了 CRISPR/Cas9 介导的突变。检测到了双等位基因和纯合敲除突变。跨越两个靶位点的缺失和小插入/缺失是最常见的突变。在测序的 22 个 SHR 等位基因中，有 21 个发生了突变。表型表征表明，具有 SHR 基因双等位基因突变的转基因根缺乏明确的内胚层单细胞层，表明其基因功能保守，类似于拟南芥 Arabidopsis thaliana (L.) Heynh 中的同源物。测序结果还揭示了该系统产生双突变体的高效性。在评估的四个转基因根中，有三个 ( yuc4/plt1 ) 和两个 ( lbd12/lbd4 ) 检测到了 yuc4/plt1 和 lbd12/lbd4 根中两个基因的双等位基因突变。最常见的突变是单个靶位点的小片段缺失或单个核苷酸插入。这种 CRISPR/Cas9 策略是一种快速、简单且标准化的基因编辑工具，可用于评估基因在杨树根部径向细胞分化等重要发育程序中的作用。
利用基因组编辑技术的基因治疗产品的质量及质量保证……
为了表征基因组编辑产品的脱靶效应，不仅需要通过计算机分析预测与目标基因序列相似序列的存在，还需要使用实验方法来分析整个人类基因组中潜在的脱靶位点[32-35]。寻找候选脱靶位点的实验方法包括在基因组编辑过程中在切割位点引入合成 DNA 标签，并在整个基因组中分析该标签的掺入情况的方法（GUIDE-seq）[36]，以及 DIGENOME-seq [37, 38]、CIRCLE-seq [39] 和 SITE-seq [40] 等方法，它们使用从细胞中提取的基因组来寻找基因组编辑酶可能的切割位点。这些分析可能包括识别癌症相关基因中的单核苷酸变异 (SNV)/插入和缺失 (Indel) 和拷贝数变异 (CNV) 等突变[41]。通过计算机分析和实验方法检测到的脱靶候选位点是否确实发生了切割或缺失的潜在方法包括对经过基因组编辑的细胞进行全基因组测序（WGS）[33, 35] 和扩增子测序，通过 PCR 扩增候选位点并进行深度测序 [42]。在这些分析中，检测灵敏度取决于碱基序列的读取深度。但是，由于新一代测序（NGS）的错误频率，检测脱靶效应非常困难，其发生频率低于0.1％（表1）。
CRISPR-Cas9 载体
CRISPR/Cas9系统已被广泛应用于基因组编辑，包括基因破坏、定点诱变、表观遗传调控等。化脓性链球菌（SpCas9）是目前最常用的Cas9蛋白。通过SpCas9进行基因组编辑需要在靶位点有一个“NGG”原型间隔区相邻基序（PAM）序列，这限制了CRISPR/Cas9系统的编辑范围。为了扩大编辑位点的范围和优化编辑特异性，各种SpCas9突变体已被研究并成功应用于CRISPR系统。
对CRISPR脱离目标网站预测的数据处理和问题表达的系统评估
crispr/cas9系统被广泛用于广泛的基因编辑范围。虽然该基因编辑技术在目标区域非常准确，但可能有许多计划外的靶标地点。因此，已经开发了大量计算方法，以预测给定指导RNA和参考基因组的靶向切割位点。但是，这些方法基于通过实验技术生成的小规模数据集（仅数十个到数百个目标位点），以检测具有较低信噪比比率的O杀目标位点。最近，一种新的体外实验技术来检测目标位点，用于生产前所未有的规模和质量的数据集（超过110个指导RNA超过200,000个O杀靶网站）。此外，同一项研究还包括58个指南RNA的指南seq实验，以产生靶位点的体内测量。在这里，我们通过利用这些数据来对数据处理进行系统评估和CRISPR OB-OR杀害目标站点预测问题的系统评估，从而填补了以前的计算方法的差距。我们的评估表明，在模型培训之前，数据转换作为预处理阶段至关重要。此外，我们通过在培训数据集中添加潜在的无效目标站点来证明获得的改进。此外，我们的结果表明，将导向RNA和o靶位点之间的不匹配数量添加为特征的重要性。在本文中，我们提出了基于体外转移学习的体内模型中的预处理的靶标模型。我们的结论将对基于高通量数据集的o实量预测变量的未来开发有所帮助。
Edit-R™ CRISPR 设计工具
图 1. Edit-R™ CRISPR 设计工具如何选择针对人类基因 PPIB 的 20 个核苷酸序列的示例。目标序列可以位于基因组 DNA 的任一链上，只要它处于 5' 到 3' 方向，并且该链的 3' 端有一个 NGG PAM（使用默认的 S. pyogenes Cas9 时）。Cas9 核酸酶将在 NGG PAM 上游三个核苷酸的位置切割 DNA 的两条链。建议选择完全位于编码基因早期组成外显子内的靶位点，但 Edit-R™ CRISPR 设计工具将返回整个编码区域的结果，因此如果需要，可以靶向特定的外显子或蛋白质结构域。
基因组/基因编辑工具的观点
摘要：从理论上讲，可以区分等于或超过16 bp的DNA序列的DNA序列特异性识别蛋白可能是哺乳动物基因组独有的。长期序列的核酸酶，例如天然存在的归巢核酸酶和人工设计的ZFN，TALEN和CAS9-SGRNA。与其他对应物（通过蛋白质部分识别DNA靶位点的其他对应物相比，CAS9使用单个指南RNA（SGRNA）作为DNA靶标识别的模板。由于设计和合成目标位点的SGRNA的简单性，CAS9-SGRNA已成为基因组编辑的最新工具。此外，Cas9-SgrNA的RNA引导的DNA识别活性与HNH结构域和RUVC结构域的非平均链中的核酸酶活性无关，而HNH核酸酶无核酶无效无效无效活性无效（H 840 A）和RUVC核酸酶核酸酶活性无效null null突变（识别10 A）。与SGRNA，CAS9，Cas9（D 10 A），Cas9（H 840 A）和Cas9（D 10 A，H 840 A）一起用于实现双重链断裂，互补的链断管破裂，非满足链破裂，并且分别在TARPEC上进行破裂。基于这种独特的特征，可以在靶位点内或周围引入许多工程酶活性，例如DNA甲基化，组蛋白甲基化，组蛋白乙酰化，胞苷脱氨酸，腺嘌呤脱氨基和启动引导突变。为了防止Cas9衍生物的持久表达靶向，开发了许多瞬态表达方法，包括直接递送Cas9-SgrNA核糖蛋白。生物安全问题在体内应用中是必不可少的；已经设计了包装到病毒样颗粒或细胞外囊泡中的CAS9-SGRNA，已经报道了一些体内治疗试验。
配体锚定聚合物对结肠疾病治疗中药物靶向作用的意义
靶向药物输送技术可以治疗各种肠道疾病，如克罗恩病、溃疡性结肠炎、结肠癌、结肠病变以及在靶位点全身输送药物。传统的结肠特异性药物输送系统缺乏特异性，在到达靶位点之前会释放大量药物。因此，确保药物在结肠有效释放的有效药物输送系统仍然是一个备受追捧的研究领域。配体锚定疗法是一种在选择性靶细胞中执行药物输送的强大而有效的方法，既可用于诊断，也可用于治疗。与常规药物相比，这种配体锚定疗法具有毒性最小、副作用少的额外优势。与健康细胞相比，患病细胞上受体表达过高导致了主动药物靶向的出现。此外，耐药性是化疗失败的主要原因之一，也是有效治疗的主要障碍。耐药性背后的原因是由于缺乏特异性的治疗方法，病理细胞/病原体暴露于亚治疗水平的药物。主动靶向，即被靶细胞特异性地吸收，可以保证病理细胞/病原体暴露于靶标的高药物负荷，而不影响非靶细胞，从而最大限度地减少对正常细胞的损害，并最大限度地降低耐药性的可能性。过去几年发现了许多配体，如抗体、适体、肽、叶酸和转铁蛋白。纳米载体的设计可以结合许多不同的功能，从而实现成像和触发细胞内药物释放等功能。本综述文章重点介绍配体锚定疗法的进展及其对靶向纳米载体进展的意义。它还将建立用于治疗结肠疾病的多靶向和多功能纳米载体等新概念。
远程随机电路中的运输和纠缠增长
具有可编程核酸酶的基因组编辑对临床翻译表现出了巨大的希望，但也揭示了由染色体易位引起的遗传毒性的风险或在脱靶位点插入突变的插入。在这里，我们描述了一种创新的测定法，以识别和量化源自CRISPR-CAS核酸酶或Talens的靶向活性的染色体畸变。cast-seq还检测了新型的染色体重排类型，包括同源性重组介导的同源介导的易位。取决于使用的设计师核酸酶，易位发生在0-0.5％的基因编辑的人类干细胞和约20％的靶基因座中含有大差点。总而言之，铸造SEQ分析与干细胞的治疗编辑特别相关，以在基因编辑产物的临床应用之前进行彻底的风险评估。