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通过两性离子聚合物结合和肽融合最大限度地降低 CRISPR/Cas9 系统的脱靶频率
目前，CRISPR/Cas9 系统已广泛应用于各类生物和细胞的基因组编辑。1,2 遗憾的是，它还会在与靶序列相似的非靶位点引起不必要的突变。3 非靶突变是由 CRISPR/Cas9 RNPs 对 DNA 序列的非特异性识别引起的。4 已证明，除了最佳 PAM 序列 5-NGG-3 之外，Cas9 还可以切割具有 5-NAG-3 或 5-NGA-3′PAM 的位点，尽管效率较低。5 此外，20 nt 的单向导 RNA（sgRNA）可以识别与 sgRNA 存在多达 3 - 5 个碱基对错配的 DNA 序列，这表明在人类基因组中特定核酸酶的可能结合位点多达数千个。 3 此外，CRISPR/Cas9 可以诱导与 RNA 引导链相比含有一些额外碱基（“ DNA 凸起”）或一些缺失碱基（“ RNA 凸起”）的 DNA 序列进行非靶向切割。6 非靶向 DNA 切割可导致
癌症中的营养表观遗传学
营养表观遗传学是指饮食在不改变 DNA 序列的情况下对基因表达的影响。饮食通过影响表观遗传因子的活性和向靶位点的募集来调节表观遗传事件，例如 DNA、RNA 和组蛋白修饰（图 1）。饮食可以促进代谢过程，产生表观遗传因子发挥作用所需的辅助因子，或提供直接结合和调节这些因子活性的分子。此外，饮食会影响转录因子的活性，从而影响表观遗传因子向基因组的募集。重要的是，用小合成分子靶向几种表观遗传因子是当前治疗某些癌症的策略。因此，饮食在癌症发生和发展中的一些有益作用可能是通过调节表观遗传机制来介导的。在本文中，我们将回顾目前用于治疗癌症的治疗靶点的有前景的表观遗传因子，以及饮食产品在调节其活性方面的潜在影响。
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我们的目标是利用腺嘌呤碱基编辑器，通过介导 AT 到 GC 碱基的转化，在特定靶位点的人类 CD34+ 造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中产生单核苷酸多态性，从而治疗镰状细胞病。虽然离体基因编辑方法显示出巨大的治疗前景，但由于需要自体造血干细胞 (HSC) 移植来递送离体编辑的细胞，因此获取途径有限。为了进一步增加有资格接受碱基编辑治疗的患者数量，我们正在开发一种替代方法，通过非病毒递送方法将碱基编辑器直接递送到体内的 HSC。脂质纳米颗粒 (LNP) 是一种经过临床验证的非病毒方法，可以递送核酸有效载荷，从而可以避免与离体方法相关的挑战，包括移植编辑的 CD34+ HSPC。
用于 CRISPR 基因治疗的延时安全开关的设计
转录因子结合靶位点产生超敏性。sgRNA浓度（输出）在阈值附近对TF浓度（输入）高度敏感。（B）Cas9-sgRNA与TF之间的超敏关系。（C）时间延迟的TF消除。Cas9-sgRNA（酶）与TF（底物）之间建立超敏关系。（D）时间延迟的Cas9消除。Cas9-sgRNA（酶）与Cas9质粒（底物）之间建立超敏关系。与Cas9质粒相比，Cas9蛋白的响应具有短暂的延迟。Cas9蛋白在快速消除之前维持一定值。（E）Hill系数n越高（n=1、2、3、4、5、6），Cas9-sgRNA浓度（输出）对Cas9质粒浓度（刺激）的响应越敏感。（F）Hill系数n值越高，延迟时间越长，Cas9消除速度差异越大。
利用 CRISPR/Cas9 破坏大黄鱼 (Larimichthys crocea) 中的 mstn 基因
mstnab +/− 鲤鱼的体长显著增加（Shahi et al.，2022），为经济鱼类的养殖产量提供了有希望的方向。因此，我们选择大黄鱼的mstnb作为靶基因。经检测，我们设计的针对外显子1中编码序列的8个靶标中的两个sgRNA是有效的（图1b）。与野生型鱼中的序列相比，检测到了5个缺失突变，包括同时发生的12 bp、28 bp、36 bp、83 bp和97 bp缺失（图2c）。与单个gRNA微注射（Shahi et al.，2022，Tao et al.，2021，Zhang et al.，2020b）不同，同时注射多个gRNA可能诱导两个靶位点之间更大片段的缺失（图2c）。该方法也被考虑并应用于斑马鱼视网膜疾病模型研究中，采用基于CRISPR/Cas9系统的更快速有效的策略
axolotl表观遗传时钟提供了可忽略的衰老本质的见解
†这些作者对这项工作也同样贡献了这项工作 *与：maximina.yun@tu-dresden.de，shorvath@altoslabs.com相互贡献。可质量衰老的生物。axolotls是否显示衰老的表观遗传标志仍然未知。在这里，我们在整个生命周期中探测了Axolotl DNA甲基甲基，并介绍其第一个表观遗传时钟。在组织特异性或泛 - 组织水平上，时钟都是双相，能够预测早期年龄的年龄，但不能预测其剩余寿命。我们表明，在早期生命中表观遗传衰老的进化保守特征，但它们的甲基团在整个寿命中都非常稳定，包括在Polycomb抑制性复合物2（PRC2）靶位点，表明该物种偏离已知的表观遗传性衰老模式。最后，我们在再生后发现了结构 - 特定的复兴事件。这项研究提供了对衰老可忽略的分子见解，并进一步了解了我们对再生与衰老之间相互作用的理解。
代谢组学在评估 CRISPR/Cas9 技术应用导致的全球成分变化方面的潜力
最明显的方法包括计算机模拟计算相似的靶位点，然后进行体外和体内检测或全基因组分析（Cameron 等人，2017 年；Young 等人，2019 年；Wienert 等人，2019 年；Lee 等人，2020 年；Naeem 等人，2020 年）。尽管最近取得了进展，但基因组测序既费力又昂贵，可能无法区分精确的变化与后代中自然发生的变异。此外，加工食品不含 DNA 完整性或 DNA 完整性缺失，阻碍了对基因编辑食品成分的准确测定（Weighardt，2007 年；Primrose，2020 年）。代谢组学可能是另一种筛选方法。代谢组学测量细胞过程的最终产物，并提供比有限数量的基于 DNA 的标记更全面的相应基因型信息（Perez-Fons 等人，2020 年）。代谢组是基因表达变化的直接和间接结果
CRISPR/Cpf1 系统的兴起，助力植物高效基因组编辑
Cpf1 是 2 类 CRISPR 家族的内切酶，它填补了 TALEN、ZFN 和 CRISPR/Cas9 等基因组工程工具领域之前面临的空白。其他同时发现的核酸酶无法在同一区域进行重新工程，因为首次工程后会丢失靶位点。Cpf1 充当双核酸酶，既可作为内切核糖核酸酶处理 crRNA，又可作为内切脱氧核糖核酸酶切割靶序列并产生双链断裂。此外，Cpf1 允许多重基因组编辑，因为单个 crRNA 阵列转录本可以靶向基因组中的多个基因座。CRISPR/Cpf1 系统可在单子叶植物和双子叶植物中进行基因删除、插入、碱基编辑和基因座标记，且脱靶效应更少。该工具已在烟草、水稻、大豆、小麦等作物中得到有效验证。本综述介绍了Cpf1介导的基因组编辑技术在植物中的开发和应用。
利用 mRNA 和合成向导 RNA 进行碱基编辑的精准平台
精确定位碱基编辑平台的开发目的是通过使用 RNA 适体 (Collantes, 2021) 来有效招募碱基修饰酶。精确定位碱基编辑系统可有效诱导靶标特异性核苷酸变化，而不会形成 DNA 双链断裂或插入缺失。该系统由三个部分组成：[1] 核酸酶缺陷型“切口酶” nCas9，仅切割或“切口”单链 DNA，与尿嘧啶糖基化酶 (UGI) 抑制剂融合 (Komor, 2016)，[2] 胞苷脱氨酶碱基编辑器 (大鼠 APOBEC) 与适体结合蛋白融合，以及 [3] 适体单向导 RNA (sgRNA)，可将 nCas9 和适体-脱氨酶融合物招募到特定的 DNA 靶位点（图 1）。将这三种成分递送到哺乳动物细胞中可诱导高度特定水平的 CG 到 TA 碱基转化，适用于涉及单个氨基酸点突变或功能性基因敲除的细胞和基因治疗应用。
除草剂作为植物生物学探针
除草剂是抑制植物生化途径和/或生理过程中特定分子靶位点的小分子。对这些部位的抑制通常会产生灾难性的后果，对植物致命。这些化合物对各自目标位点的亲和力使它们成为研究和剖析植物生化和生理过程的复杂性的有用工具。例如，阐明光合电子传输链的一部分是通过使用除草剂（例如Terbutryn和Paraquat）来实现的，这些链分别对光系统II和I作用，作为生理探针。源于发现PS II抑制除草剂的约束地点的作品最终于1988年获得诺贝尔奖。尽管不像光合作用的开创性工作那样享有声望，但我们对许多其他植物过程的了解通过巧妙地使用抑制剂作为分子探针而显着扩展。示例突出了除草剂在扩展我们对卟啉合成基本方面的理解和非层状途径的基本方面所起的关键作用标记。关键词：分子探针，除草剂作为工具，化学遗传学，蛋白质组学，代谢组学，基因组学，作用方式。