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通过基因打靶和随后的单链退火介导的标记基因切除，在植物中对 miRNA 靶位进行精确的基因组编辑
基因打靶 (GT) 能够使用供体 DNA 作为模板进行精确的基因组修饰（例如，引入碱基替换）。结合用于选择 GT 细胞的选择标记的干净切除，GT 有望成为一种标准的、普遍适用的碱基编辑系统。之前，我们展示了通过 piggyBac 转座子从水稻中 GT 修饰的位点进行标记切除。然而，piggyBac 介导的标记切除的局限性在于它只能识别 TTAA 序列。最近，我们提出了一种新颖的通用精确基因组编辑系统，该系统由 GT 和随后的单链退火 (SSA) 介导的标记切除组成，原则上不受靶序列的限制。在本研究中，我们将碱基替换引入了 OsCly1 基因的 microRNA miR172 靶位点，OsCly1 基因是参与闭花授粉开花的大麦 Cleistogamy1 基因的直系同源物。为确保有效的 SSA，GT 载体在选择标记的两端都含有 1.2 kb 的重叠序列。使用带有重叠序列的载体进行正负选择介导的 GT 的频率与使用不带重叠序列的 piggyBac 介导的标记切除载体的频率相当，在 T 0 代中，SSA 介导的标记切除频率计算为 ∼ 40%。这个频率被认为足以产生无标记细胞，尽管它低于使用 piggyBac 介导的标记切除的频率（接近 100%）。到目前为止，使用碱基编辑器和基于 CRISPR/Cas9 的 prime 编辑系统在目标基因的不连续多个碱基中引入精确替换已经相当困难。在这里，利用 GT 和我们的 SSA 介导的标记切除系统，我们成功地在 OsCly1 基因的 miR172 靶位点上不仅实现了单个碱基的精确替换，而且还实现了人工不连续的多个碱基的精确替换。
在CRISPR-CAS裂解动力学和特异性的体外分析
摘要基因治疗是通过破坏与疾病相关基因的表达或替换或纠正受影响细胞类型中突变的基因座的表达来治疗遗传性疾病，癌症或传染病。除了常规的基因转移方案外，设计器核酸酶（例如锌指核酸酶，故事核酸酶，巨核酸酶或CRISPR-CAS核酸酶）在该领域中越来越重要。使用设计师的核酸内切酶的使用使研究人员可以通过促进DNA双链断裂来校正有害突变。CRISPR-CAS技术被广泛用作强大的基因组编辑工具，因为它的简单性质由单个RNA分子引导到目标位点的核酸酶组成。尽管如此，主要问题之一是CRISPR-CAS系统的脱靶活动，该活动与特定的CRISPR-CAS核糖核蛋白（RNP）络合物针对基因组中其他序列的相似性有关。先前的研究表明，除了序列同源性外，靶向活性与细胞中的RNP浓度和基因组暴露于这些RNP的时间正相关。到目前为止，还没有执行很多测定，这些测定详细介绍了影响开目标和脱靶裂解动力学的参数。在我的主论文项目中，我开发了新颖的体外方法，以评估各种参数对靶向和脱靶裂解动力学和切割效率的影响。我的结果表明，CRISPR-CAS DNA裂解动力学在很大程度上取决于RNP，DNA靶位点和RNP脱靶结合位点的浓度。i发现，靶向裂解动力学和效率取决于（i）目标序列本身，（ii）RNPS和靶位点之间的比率，（iii）RNP的浓度，（iv），（iv）非目标裂解位点的浓度以及（v）（v）（v）off target结合位点的浓度。数据表明，单元格中的切割效率不仅取决于目标位点组成本身，而且还取决于脱靶裂解位点的数量，更重要的是 - 更重要的是 - 非目标结合位点的数量。
Multilink™ 是一种新型连接技术，可增强药物与...的结合。
抗体药物偶联物 (ADC) 能够将细胞毒性药物靶向递送至肿瘤细胞。理想情况下，ADC 应保留抗体的良好药代动力学和功能特性，在体循环中保持完整无毒，并在靶位点激活并释放足够的药物以杀死靶细胞。ADC 开发中的一个主要挑战是接头的设计。Multilink TM 是一种新型接头，可被组织蛋白酶 B 1,2 的羧基二肽酶活性选择性识别和裂解。这种新型接头系统可实现高效和选择性的药物释放。它在血浆中也很稳定，并且能够制备具有高药物抗体比 (DAR) 的 ADC。增加杀死它们的机会。
Cas12a 针对多重基因组的优化
图 1. 现有 Cas12a CRISPRa 技术的评估。A) 采用两种不同的 Cas12a 核酸酶失活突变的 CRISPRa 构建体的比较。通过转导五天后表达 CD4 的细胞百分比来测量激活程度。B) 针对采用直接与 dCas12a (D908A) 连接的 TAD 组合的 12 种 CRISPRa 构建体变体，以基线表达为标准对 CD4 平均荧光强度 (MFI)。C) 示意图描绘了基于流式细胞术的平铺筛选的概览，该筛选用于识别其他活性 Cas12a CRISPRa 指南。D) 根据指南靶位点相对于 CD4、CD26、CD97 和 CD274 的转录起始位点 (TSS) 的位置绘制了每个指南在技术重复中的绝对最小 LFC 的 Z 分数。
CRISPR/Cas9 基因编辑中的脱靶效应
基因编辑是指精确改变特定核酸序列的方法。随着成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/Cas9 系统的最新发展，基因编辑变得高效、方便和可编程，为遗传和非遗传疾病的转化研究和临床试验带来了希望。CRISPR/Cas9 系统应用中的一个主要问题是其脱靶效应，即在基因组中产生意想不到的、不需要的甚至是不利的改变。迄今为止，已经开发出许多方法来指定或检测 CRISPR/Cas9 的脱靶位点，这为成功升级具有更高精确度的 CRISPR/Cas9 衍生物奠定了基础。在这篇综述中，我们总结了这些技术进步，并讨论了未来基因治疗在脱靶效应管理方面面临的当前挑战。
人类基因治疗基因组编辑技术的监管及安全性评估
摘要：基因组编辑技术，包括成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统，有望成为人类基因治疗的最新策略。然而，在临床使用之前，有几个新的安全问题需要解决。这篇综述文章总结了人类基因治疗基因组编辑安全性评估的当前监管现状。此外，本综述重点介绍了 CRISPR/Cas9 系统的意外基因组编辑，概述了用于检测脱靶位点的方法，并介绍了日本医疗研究和发展机构 (AMED) 的监管科学 (RS) 研究项目为基因组编辑开发的体外基因组编辑细胞产品的安全性评估拟议技术指南。关键词：基因组编辑、基因治疗、安全性、脱靶编辑、监管科学
利用 ARCUS 巨核酸酶消除乙肝病毒的基因编辑方法
图 3：HBV-ARCUS-POL 核酸酶在各代中表现出更高的特异性 • 含有一个部分整合的 HBV 基因组的 HepG2 细胞被转染了高水平的 HBV-ARCUS- POL 核酸酶以及 DNA“标签”。分离 gDNA 并使用 Oligo Capture NGS 评估脱靶编辑。 • 每个蓝点代表一个潜在的切割位点，X 轴表示恢复的读取次数，点的颜色表示每个位点与预期的 22bp 目标位点相比的错配数。 • 最有可能真实的脱靶位点是那些具有大量读取次数或错配较少的位点。这些包含在黄色轮廓框内。橙色圆圈表示已整合到 HepG2 细胞系基因组中的预期目标位点。
意见增强剂的非规范函数：RNA聚合酶III转录，DNA复制和V（d）J重组的调节
增强子是其他基于DNA的过程的关键调节因子，因为它们以高度调节的方式产生核小体耗尽区域的独特能力。增强子通过RNA聚合酶III（POL III）调节TRNA基因的细胞类型特异性转录。他们还负责原点复制复合复合物（ORC）与DNA复制起源的结合，从而调节原点利用，复制时机和依赖复制的染色体断裂。此外，增强剂通过增加重组激活基因（RAG）重组酶对靶位点的访问以及通过产生由RAG2 PHD域识别的三甲基化组蛋白H3-K4的局部区域来调节V（d）J重组。因此，增强子代表了解码基因组的第一步，因此它们调节生物学过程，这些过程与RNA聚合酶II（POL II）转录不同，没有专用的调节蛋白。
J. A MER . S OC . H ORT . S CI . 148(6):266 – 275. 2023. https://doi.org/10.21273/JASHS05311-23 CRISPR/Cas9 介导的菊粉双靶向诱变
摘要 。橡胶蒲公英 ( Taraxacum kok-saghyz ) 是一种天然产橡胶的蒲公英，具有成为工业作物的潜力。菊粉是橡胶蒲公英中的储存碳水化合物，其合成与橡胶生产竞争同化碳。我们使用成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 (Cas) 系统同时靶向编码 1-果聚糖的基因中的两个位点：果聚糖-1-果糖基转移酶基因 (1-FFT)，这是菊粉生物合成中的关键酶。使用发根农杆菌和根癌农杆菌介导的植物转化方法产生具有 CRISPR/Cas9 元件的转基因植物。通过 A 的转化率分别为 71% 和 64%。 rhizogenes 和 A. tumefaciens 介导的转化分别对转基因橡胶蒲公英和根癌农杆菌介导的转化进行了研究。通过限制性位点丢失法和桑格测序证实了诱变。在通过 A. rhizogenes 获得的 13 株转基因植物中，有 6 株显示 1-FFT 基因内的两个靶位点均进行了编辑。使用 A. rhizogenes 介导的转化在 10 周内获得了转基因橡胶蒲公英植物，这比 A. tumafaciens 转化子所需的 6 个月要快得多。在通过 A. tumefaciens 获得的 11 株转基因植物中，有 5 株在两个靶位点都发生了突变。逆转录聚合酶链式反应证实了所有编辑转化子中 Cas9 的表达。A. rhizogenes 介导的双突变转化子和 A. tumefaciens 介导的双突变转化子的菊粉含量都低于野生型植物。此外，A. rhizogenes 介导的转化体的橡胶含量高于野生型植物。因此，本研究验证了使用 CRISPR/Cas9 基因编辑作为橡胶蒲公英中产生有用突变的有效工具，并且可以在未来的作物改良方法中实施。
CRISPR 筛选：研究病毒的分子工具——...
病毒是专性病原体，利用宿主细胞机制进行复制。宿主细胞可以识别病毒并激活抗病毒反应。揭示影响病毒感染的因素有助于发现新的候选药物。使用有助于抗病毒免疫反应的特异性免疫激动剂是治疗感染的另一种方法。最近，使用新的综合分子工具（例如成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR) 筛选）研究宿主细胞相互作用并确定开发新抗病毒药物的关键靶标已成为可能。在过去十年中，CRISPR/CRISPR 相关蛋白 (Cas) 系统已被用于基因组编辑。仅当基因组靶标后面跟着一个原间隔区相邻基序 (PAM) 序列（Cas9 蛋白为 NGG，Cas12a 蛋白为 TTTV）时，Cas 蛋白才会使用 II 型 CRISPR 系统中的单向导 RNA (sgRNA) 和 V 型系统中的 CRISPR RNA (crRNA)（为简单起见，在本综述中称为 gRNA）识别靶位点。在识别靶位点后，Cas 蛋白会解开 DNA 链，形成 R 环结构，并切断两条链，导致 DNA 双链断裂 (DSB)。利用位点特异性诱变，已经生成了具有核酸酶钝结构域的 Cas 内切酶变体，称为核酸酶失活 Cas (dCas) 蛋白。dCas 保留了结合目标位点的能力，但不能将 DSB 引入 DNA。将不同的功能域融合到 dCas 蛋白上，可将其转化为具有多种功能的分子“瑞士军刀”，例如单核苷酸编辑和调节转录和表观遗传学 [1]。通过不同的 CRISPR/Cas 系统激活或抑制靶基因转录已被广泛用于破坏单个基因和研究病毒-宿主相互作用 [2]。通过设计和合成数千个针对多个目标基因或基因组中所有基因的 gRNA，可以使用 CRISPR/Cas