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通过改进的形态学调节辅助转化方案在热带玉米线中启用基因组编辑
许多玉米（Zea Mays）基因型在传统的遗传转化方案中表现出的顽固性对基因组编辑（GE）在这一主要农作物中的大规模应用（GE）构成了重大挑战。尽管一些玉米基因型被广泛用于遗传转化，但它们不适合在领域试验或商业应用中进行农艺学测试。尽管在热带地区发生了相当多的玉米产量，但可转化的玉米线的优势加剧了这一挑战。异位表达是克服低效率和基因型依赖性的一种有前途的方法，旨在实现玉米中的“普遍”转化和GE能力。在这里，我们使用基于MR的农杆菌介导的转化方案报告了具有农学相关的热带玉米线的成功GE，先前已针对B104温带近交系列进行了优化。为此，我们使用了一种基于CRISPR/CAS9的构造，该结构旨在敲除蛋白质黄色（VYL）基因的敲除，这导致了易于识别的表型。在从B104和三个热带品系制备的原生质体中验证了Vyl处的突变，无论在两个热带线中，在Vyl靶位点的种子区域存在单个核苷酸多态性（SNP）。三个超过五个热带线可以转化，效率高达6.63％。非常明显，在目标部位呈现的Indels的回收事件中有97％是由下一代继承的。我们观察到基于CRISPR/Cas9的构造对Vyl Paralog Vyl-Modifier的靶向活动，这可能部分是由于
CRISPR/Cas9 介导的 Tamyb10 修复，以创造收获前抗发芽红小麦
小麦收获前发芽（PHS）会降低产量和籽粒质量，几乎在世界各地的小麦种植区都会发生（Vetch 等，2019）。一般而言，红粒小麦品种比白粒小麦品种对 PHS 的耐受性更强（Himi 等，2011）。此外，籽粒外皮的红色色素中含有原花青素，其抗氧化活性和自由基清除能力具有促进健康的功效。因此，培育优良红粒小麦品种是培育高产优质小麦的重要目标。R2R3-MYB 是植物中最大的转录因子家族之一，在调节植物发育、代谢和逆境反应中起着至关重要的作用。六倍体小麦的 R2R3-MYB 转录因子 Tamyb10 可激活黄酮类化合物生物合成基因，从而决定小麦粒的红色，并影响 PHS（Himi et al.，2011）。在大多数白小麦品种中，Tamyb10-A1a、Tamyb10-B1a 和 Tamyb10-D1a 基因存在大面积插入或缺失，从而破坏了 IRTKAL/IRC 基序和调控功能（Himi et al.，2011）。在 Tamyb10 基因中，Tamyb10-B1a 等位基因在近 88.6% 的面包小麦品系中发生 19 bp 的缺失；该缺失导致开放阅读框移码，并破坏了所产生的蛋白质（Dong et al.，2015；Himi et al.，2011）。鉴于 CRISPR/Cas9 诱导的突变通常在特定靶位点处为 +1/1 bp 插入/缺失 (Zhang et al., 2014 , 2016 )，我们可以恢复 Tamyb10-B1a 等位基因内的移码突变（由 19 bp
CRISPR Cas9 编辑多聚半乳糖醛酸酶 FaPG1 ...
硬度是草莓最重要的果实品质性状之一。这种软果实采后保质期在很大程度上受到硬度损失的限制，而细胞壁的分解起着重要作用。先前的研究表明，多聚半乳糖醛酸酶 FaPG1 在草莓软化过程中对果胶的重塑起着关键作用。在本研究中，使用农杆菌传递的 CRISPR/Cas9 系统生成了 FaPG1 敲除草莓植株。获得了 10 个独立品系 cv.“Chandler”，经 PCR 扩增和 T7 内切酶测定确定所有品系均已成功编辑。使用靶向深度测序分析了定向诱变插入和删除率。编辑序列的百分比从 47% 到几乎 100% 不等，其中 7 个选定品系的编辑序列百分比高于 95%。表型分析表明，在所分析的 8 个品系中，有 7 个品系产生的果实明显比对照更坚硬，硬度增加了 33% 到 70%。 FaPG1 编辑程度与果实硬度增加呈正相关。其他果实品质特征（如颜色、可溶性固体、可滴定酸度或花青素含量）的变化很小。编辑后的果实在采后软化率降低，蒸腾水分损失减少，受灰葡萄孢菌接种的损害较小。对四个潜在脱靶位点的分析未发现突变事件。总之，使用 CRISPR/Cas9 系统编辑 FaPG1 基因是提高草莓果实硬度和保质期的有效方法。
简讯 通过同源定向修复实现小麦体内精准基因组编辑
通过同源定向修复 (HDR) 进行的基因组编辑 (GE) 可以最大程度地灵活地修改基因组。先前的基因打靶 (GT) 研究表明，将带有供体模板的 Cas9 或 Cas12a 表达盒通过基因枪递送到水稻愈伤组织中，可以使用 HDR 途径在靶位点进行精确替换或插入 (Li et al., 2016 , 2018 , 2019 ; Lu et al., 2020 )。其他研究小组还报告在玉米 (Svitashev et al., 2016 ) 和大麦 (Lawrenson et al., 2021 ) 中成功创建 GT 植物。然而，这些策略仅适用于适合细胞培养和再生的基因型。为了规避与细胞培养和再生相关的限制，我们最近开发了植物内粒子轰击 (iPB) 方法，该方法允许在小麦中进行基因型独立的基因组编辑 (Hamada 等人，2017 年；Liu 等人，2021 年)。iPB 方法利用茎尖分生组织 (SAM)，其中包含注定在花发育过程中发育成生殖细胞的表皮下层 (L2) 细胞。成功将 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 递送到 SAM 可促进基因组编辑的发生，并可遗传给下一代 (Kumagai 等人，2022 年)。由于 SAM 具有细胞分裂活跃的特点，许多细胞处于 HDR 的先决条件 G2/M 阶段，我们假设可以通过 iPB 方法将设计的供体 DNA 与 RNP 一起递送到小麦 SAM 中，实现基于 HDR 的 GT（图 1a）。
SMOOT 文库和噬菌体诱导的 Cas9 定向进化可减少脱靶活性
RNA 引导的核酸内切酶（如 Cas9）可在细胞中提供有效的靶向基因组编辑，但也可能切割整个基因组中的脱靶位点。化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 的工程变体已被开发出来以全面降低脱靶活性，但个别脱靶可能仍然存在，或者靶向活性可能受到损害。为了在保持强大的靶向编辑的同时对抗特定脱靶的活性，我们开发了一种新颖的 M13 噬菌体介导选择方法。使用这种方法，连续几轮正向和负向选择用于识别增强或减弱特定基因组序列编辑活性的 Cas9 突变。我们还引入了寡核苷酸定向靶标扫描诱变 (SMOOT)，这是一种全面的诱变方法，用于创建高度多样化的 Cas9 变体库，这些库可以通过基于噬菌体的选择进行挑战。我们的平台识别出新的 SpCas9 突变体，这些突变体在生化测定和 T 细胞中减轻了对脱靶的切割，同时保持了比以前描述的变体更高的靶向活性。我们描述了一种进化的变体，S . pyogenes Adapted to Reduce Target Ambiguity Cas9 (SpartaCas)，它由最丰富的突变组成，每个突变的功能未知。这种进化的 Cas9 突变体减少了脱靶切割，同时保留了对多个治疗相关靶标的有效编辑。使用我们的系统对 Cas9 进行定向进化展示了一种改进的结构独立方法，可以有效地设计核酸酶活性。
通过 CRISPR/Cas9 RNP 创造的长保质期甜瓜……
图 1 甜瓜植物体内 RNP 介导的基因组编辑。(a) 微粒介导的 GFP 基因转移到甜瓜 SAM。(b) 甜瓜基因组编辑 iPB-RNP 方法概述。(c) 携带目标 CmGAD1 基因座突变的阳性 E 0 植物的 CAPS 分析。符号“–”和“+”分别表示不使用和使用 Cas9 RNP 的消化。黑色和白色三角形分别表示 Cas9 RNP 处理后的未消化和消化条带。(d) 阳性 E 0 植物的 CRISPR/Cas9 靶序列与野生型的 CRISPR/Cas9 靶序列的比对，插入和缺失用红色字母突出显示。(e) 对来自两个 E 0 植物（#2-13 和 #2-16）的 E 1 植物进行基因特异性 CAPS 分析，使用与 (c) 中相同的符号。(f) 具有 gRNA 设计的 CmACO1 基因示意图。 (g) 针对 CmACO1 的基因组编辑实验总结。(h) cmaco1 纯合突变系 (#3-2，E 2 代) 的基因特异性 CAPS 分析，使用与 (c) 一致的符号。(i) 野生型和 cmaco1 中 CmACO1 的氨基酸序列比较，CRISPR/Cas9 的靶位点用下划线表示，序列变化用红色字母表示。星号表示终止密码子。(j 和 k) 收获后野生型和 cmaco1 果实的外观 (j) 和纵切面 (k)。(l) 授粉 40 天后测量的野生型和 cmaco1 果实 (E 2 代中的个体植物 E2-1 和 E2-2) 的乙烯产生量。数据以平均值±SE (n=3) 表示。
CRISPR/Cas9 介导的番茄红素敲除
摘要：类胡萝卜素是一种有价值的色素，天然存在于所有光合植物和微藻以及某些真菌、细菌和古细菌中。绿色微藻形成了复杂的类胡萝卜素结构，适合高效采光和防光，并通过内源性 2-C-甲基-D-赤藓糖醇 4-磷酸 (MEP) 途径的强大功能具有强大的类胡萝卜素生产能力。先前的研究建立了成功的基因组编辑，并诱导了莱茵衣藻细胞类胡萝卜素含量的显著变化。本研究采用定制的类胡萝卜素途径来工程化生物生产有价值的酮类胡萝卜素虾青素。番茄红素 ε-环化酶 (LCYE) 的功能性敲除和基于非同源末端连接 (NHEJ) 的供体 DNA 在靶位点的整合会抑制 α-胡萝卜素的积累，从而抑制莱茵衣藻中丰富的类胡萝卜素叶黄素和氯黄素的积累，而不会改变细胞适应性。基于 PCR 的筛选表明，96 个再生候选系中有 4 个携带供体 DNA 的 (部分) 整合，并且 β-胡萝卜素以及衍生类胡萝卜素含量增加。与亲本菌株 UVM4 相比，Cr BKT、Pa crtB 和 Cr CHYB 的迭代过表达导致突变体 ∆ LCYE#3 (1.8 mg/L) 中的虾青素积累增加了 2.3 倍，这表明基因组编辑在设计用于虾青素生物生产的绿色细胞工厂方面具有潜力。
CRISPR Cas9 的全基因组脱靶分析 - ...
目标。利用人类 T 细胞的力量进行治疗已导致出现新兴免疫治疗策略的当前范式。T 细胞受体 (TCR) 的基因工程可重定向特异性、消除同种反应性并为新兴的过继性 T 细胞转移 (ACT) 方法带来重大进展和现成的选择。DNA 中的靶向 CRISPR/Cas9 介导的双链断裂可实现敲除或敲入工程。方法。在这里，我们使用治疗相关的核糖核蛋白 (RNP) 递送方法进行 CRISPR/Cas9 介导的 TCR 敲除，以评估基因工程 T 细胞产品的安全性。进行全基因组测序以分析 TCR 基因座处 CRISPR/Cas9 介导的 DNA 双链断裂是否与人类原代 T 细胞中的脱靶事件有关。结果。TCR a 链和 TCR b 链敲除导致高靶向 InDel 频率和功能性敲除。所有预测的脱靶位点都无法通过实验得到确认，而全基因组测序和手动整合基因组学查看器 (IGV) 审查揭示了全基因组范围内 9 个潜在的低频脱靶事件。随后在 7 个可评估位点中的 7 个中进行扩增和靶向深度测序未证实这些低频 InDel。因此，脱靶事件不太可能由 CRISPR/Cas9 工程引起。结论。全基因组测序和靶向深度测序的组合方法证实了使用 CRISPR/Cas9 介导的 TCR 敲除进行的高度特异性基因工程，而没有潜在有害的外显子脱靶效应。
CRISPR/Cas9 介导的芝麻 (Sesamum indicum L.) 高效靶向诱变
成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统已广泛应用于多种物种的靶向基因组修饰。它是一种强大的基因组编辑技术，为基因功能研究和分子育种提供了显著的益处。然而，到目前为止，还没有研究将这种基因组编辑工具应用于芝麻 (Sesamum indicum L.)，芝麻是最古老和最重要的油料作物之一，广泛用于食品和医药等多个行业。在此，CRISPR/Cas9 系统与毛状根转化一起被用于诱导芝麻的靶向诱变。设计了两个单向导 RNA (sgRNA) 来靶向两个芝麻细胞色素 P450 基因 (CYP81Q1 和 CYP92B14)，它们分别是芝麻素和芝麻林的关键生物合成基因。测序数据显示目标位点发生了预期的 InDel 突变，CYP81Q1 和 CYP92B14 的突变频率分别为 90.63% 和 93.33%。最常见的编辑事件是单核苷酸缺失和插入。对 CYP92B14 -sgRNA 潜在脱靶位点的测序表明，在三个错配的情况下均未发生脱靶事件。高效液相色谱分析表明，突变的毛状根中芝麻素和芝麻林林的生物合成被有效破坏，证实了 CYP81Q1 和 CYP92B14 在芝麻木脂素生物合成中的关键作用。这些结果表明 CRISPR/Cas9 系统可以有效地实现定点诱变，并且 CRISPR/Cas9 结合毛状根转化是评估芝麻基因功能的有效工具。
CRISPR/Cas9 介导双等位基因 F0 海葵鱼 (Amphiprion ocellaris) 突变体的产生
基因组操作是一种有用的方法，可用于阐明发育、生理和行为方面的分子途径。然而，由于缺乏适用于珊瑚鱼的基因编辑工具，因此它们许多独特特征的遗传基础仍有待研究。一种适合应用这种技术的标志性珊瑚鱼群是海葵鱼 (Amphiprioninae)，因为它们与海葵共生、雌雄同体、复杂的社会等级、皮肤图案发展和视觉，并且相对容易在水族箱中饲养，因此被广泛研究。在这项研究中，我们开发了一种基因编辑方案，用于将 CRISPR/Cas9 系统应用于眼斑海葵鱼 (Amphiprion ocellaris)。受精卵的显微注射用于证明我们的 CRISPR/Cas9 方法在两个不同靶位点的成功应用：与视觉有关的视紫红质样 2B 视蛋白编码基因 (RH2B) 和与黑色素生成的酪氨酸酶生成基因 (tyr)。对眼斑海马胚胎中测序的靶基因区域进行分析表明，注射胚胎的吸收率高达 73.3%。进一步分析亚克隆的突变基因序列并结合扩增子散弹枪测序表明，我们的方法在 F0 眼斑海马胚胎中产生双等位基因突变的效率为 75% 到 100%。此外，我们清楚地显示了 tyr 突变胚胎的功能丧失，其表现出典型的低黑色素表型。该方案旨在作为进一步探索 CRISPR/Cas9 在眼斑海马中潜在应用的有用起点。眼斑鱼，作为研究小丑鱼和其他珊瑚鱼基因功能的平台。