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纯化mRNA后,将寡-DT(脱氧 - 胸腺苷核苷酸的短序列)标记为互补底漆,该引物与poly-A尾巴结合,从而可以通过反转录酶来扩展自由3'-OH端,以创建互补的DNA链。现在,使用RNase酶去除去mRNA,将单个链cDNA(SSCDNA)取出。借助于DNA聚合酶,将此SSCDNA转化为双链DNA。但是,要使DNA聚合酶合成互补链,需要3'- oh-end。这是由SSCDNA本身通过在3'端产生发夹循环来通过围绕自身来提供的。聚合酶延伸了3'-OH端,然后通过S 1核酸酶的剪刀作用打开3'端的环。然后,使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶来克隆序列到细菌质粒中。

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