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2。在有指导RNA的情况下与靶DNA结合,只要目标是原始的邻接基序的上游(5'),GRNA和cas9核酸内切酶都会形成Cas9:GRNA复合物。cas9核酸内切酶与靶基因组基因核基因座结合均由导向RNA中包含的靶序列介导,又介导了一个3碱基对序列,称为原始序列相邻基序或PAM。为了通过CAS9切割DsDNA,它必须立即包含由导向RNA靶向的位点下游(3')的PAM序列。在没有引导RNA或PAM序列的情况下,CAS9既不会结合也不会切割目标。Cas9同源物(请参见下表)具有不同的PAM要求。这些不同的PAM要求使研究人员能够针对许多不同的基因组基因座。

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