结果:为了应对这些挑战,我们设计了一种紧凑的无酶表观遗传编辑器,称为 CHARM(偶联组蛋白尾,用于甲基转移酶的自抑制释放)。通过与组蛋白 H3 尾和非催化性 Dnmt3l 结构域直接融合,CHARM 能够募集和激活细胞内源性表达的 DNA 甲基转移酶,以甲基化靶基因。CHARM 可以独立于 KRAB 转录抑制结构域发挥作用,并与多种 DNA 结合方式兼容,包括 CRISPR-Cas、转录激活因子样效应物和锌指蛋白。锌指蛋白体积小,最多可容纳三个 DNA 靶向元件,并有额外的空间容纳调节元件,以赋予细胞类型特异性。当与靶向锌指结构域的朊病毒蛋白结合并通过 AAV 递送到小鼠大脑时,CHARM 会甲基化朊病毒基因启动子,并使全脑神经元朊病毒蛋白减少高达 80%,远远超过治疗效果所需的最低减少量。此外,我们开发了自我沉默 CHARM,它们在沉默靶标后会自主停用。这种方法暂时限制了 CHARM 表达,以避免因非分裂神经元中的慢性表达而导致的潜在抗原性和脱靶活性。
转录后基因沉默 (PTGS) 是了解和控制植物代谢途径的有力工具,是植物生物技术的核心。PTGS 通常通过将小干扰 RNA (siRNA) 递送到细胞中来实现。标准的植物 siRNA 递送方法(农杆菌和病毒)涉及将 siRNA 编码到 DNA 载体中,并且仅适用于某些植物物种。在这里,我们开发了一个基于纳米管的平台,用于直接递送 siRNA,并在完整的植物细胞中显示出高沉默效率。我们证明纳米管成功递送 siRNA 并沉默内源基因,这归功于有效的细胞内递送和纳米管诱导的保护 siRNA 免受核酸酶降解。这项研究表明,纳米管可以实现大量依赖于 RNA 递送到完整细胞的植物生物技术应用。
RNA干扰(RNAi)是一种生物技术工具,用于植物中的基因沉默,具有内源性和外源性应用。内源性方法,例如宿主诱导的基因沉默(HIG),涉及基因修饰(GM)植物,而外源方法包括喷雾诱导的基因沉默(SIGS)。RNAi机制取决于引入双链RNA(dsRNA),该RNA被处理成简短的干扰RNA(siRNA),从而降低了特定的Messenger RNA(mRNA)。然而,由于序列同源性或siRNA诱导的表观遗传变化,对非目标生物和GM植物的意外影响是一个问题。EPA和EFSA等监管机构强调需要进行全面的风险评估。检测意外效果是复杂的,通常依靠生物信息学工具和不靶向的分析(例如转录组学和代谢组学),尽管这些方法需要广泛的基因组数据。本综述旨在对植物中不同来源的简短干扰RNA引起的RNAi效应的机制进行分类,并确定可用于检测这些作用的技术。此外,总结了实际案例研究,并讨论了以前对基因修饰植物中的意外RNAi效应进行了研究。当前文献受到限制,但表明RNAi是相对特定的,在GM作物中几乎没有意外的影响。但是,需要进一步的研究来充分理解和减轻潜在风险,尤其是与转录基因沉默(TGS)机制相关的风险,这些机制比转录后基因沉默(PTGS)不那么可预测。尤其是应用不靶向方法的应用,例如小的RNA测序和转录组学,以进行彻底和全面的风险评估。
在 CRISPR-Cas 系统中,Cas13a 是一种 RNA 引导的 RNA 核酸酶,专门靶向单链 RNA。我们开发了一种 Cas13a 介导的 CRISPR 干扰工具,以靶向 mRNA 来实现蚊子的基因沉默。通过胸内注射将表达 Cas13a 的质粒递送给蚊子,递送后至少 10 天仍可检测到 Cas13a 转录本。使用 T7 RNA 聚合酶在体外合成靶向特异性 crRNA。Cas13a 质粒和靶向 crRNA 可以通过胸内注射一起递送,或者可以先提供 Cas13a 构建体,然后在适当的时候提供靶向 crRNA。在两种蚊子中测试了该机制。在冈比亚按蚊中,卵黄蛋白基因被 Cas13a/Vg-crRNA 沉默,同时伴有产卵量显著下降。在埃及伊蚊中,COPI 基因的 α 和 δ 亚基被 Cas13a/crRNA 沉默,导致死亡和中肠脆弱,重现了之前报道的表型。当提供目标 crRNA 混合物时,可以同时实现基因共沉默。研究中未观察到非目标转录本的可检测的附带切割。除了 dsRNA 或 siRNA 介导的 RNA 干扰外,可编程的 CRISPR 干扰方法提供了一种在蚊子中敲除基因的替代方法。
简介:长期非编码RNA(LNCRNA)在脑缺血再灌注(CI/R)损伤中起关键作用。当前研究的目的是研究CI/R损伤中LNCRNA人白细胞抗原复合物11(HCG11)的调节作用,并探索其潜在机制。材料和方法:建立大鼠中大脑中动脉闭塞(MCAO)模型以模拟体内CI/R损伤。通过定量逆转录PCR(RT-QPCR)检测到HCG11,microRNA(miR)-381-3p,肿瘤蛋白p53和神经炎症因子的mRNA水平。Bederson评分和LONGA评分评估了神经功能障碍。三苯基四唑氯化物(TTC)染色用于检查脑梗塞体积。更重要的是,商业试剂盒还评估了氧化应激。最后,通过双脂肪酶报告基因测定法测定了HCG11,miR-381-3p和p53之间的关系。结果:MCAO大鼠的HCG11升高。及其有竞争力地绑定miR-381-3p,并下调了p53的表现。抑制HCG11抑制了MCAO大鼠的脑梗死体积和神经功能缺陷,并抑制了神经炎症的分泌和氧化应激的过度激活,从而产生了CI/R损伤的保护作用。然而,大鼠中miR-381-3p的抑制显着削弱了MCAO大鼠HCG11抑郁症的保护作用,从而导致脑梗塞量增加和神经系统缺陷增加,神经炎症分泌升高,氧化应激激活。结论:本研究表明,LNCRNA HCG11沉默可以通过miR-381-3p预防脑缺血/再灌注损伤以调节p53。
受控转基因表达是基因治疗、细胞治疗和生物制造不可或缺的组成部分。然而,大多数应用都基于转录因子的调控,但这种调控存在一些问题,例如表观遗传沉默,限制了表达的寿命和可靠性。组成型转基因转录与转录后基因调控相结合可以对抗沉默,但这种 RNA 或蛋白质水平平台很少存在。我们在此开发了一个 RNA 调控平台,我们称之为“PERSIST”,它由九种 CRISPR 特异性内切酶组成,作为 RNA 级激活剂和抑制剂,以及模块化 OFF 和 ON 开关调控基序。我们表明,PERSIST 调控的转基因表现出强烈的 OFF 和 ON 反应,可抵抗至少两个月的沉默,并且可以轻松分层以构建级联、逻辑功能、开关和其他复杂的电路拓扑。该平台的正交、模块化和可组合特性以及构建稳健且可预测的基因电路的便利性,为基因和细胞疗法带来了无数应用。
摘要:E3泛素连接酶在植物免疫中起重要作用,但以前尚未研究它们在大豆中的作用。在这里,我们使用了豆荚病毒病毒(BPMV)介导的病毒诱导的基因沉默(VIGS)来研究大豆中GM Saul1(衰老相关的E3泛素连接酶1)同源物的功能。同时同时沉默了两个密切相关的SAUL1同源物时,大豆植物显示出自动免疫表型,这些表型显着缓解了高温,这表明GM Saul1a/1b可能会受到R蛋白的保护。有趣的是,沉默的GMSAUL1A/1B导致GM MPK6的激活降低,但GM MPK3的激活增加而响应于GMMPK22,这表明GM MPK3的激活很可能导致GM Saul1a/1b-Sbiled植物中观察到的激活免疫。此外,我们提供了GM Saul1a是一个振奋的E3连接酶的证据。共同表明,GM Saul1在调节大豆的细胞死亡和免疫力中起负面作用。