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开发AAV-GBA1基因替代疗法，用于通过血液屏障渗透AAV CAPSID
a-b）VG生物分布是通过DDPCR，FAM-RBGPA和VIC-MSTFRC探针来测量二倍体动物细胞的。在皮质（CTX）和丘脑（Th）中证明了跨前脑和中脑区域的成功基因转移。最小基因转移（<1VG/细胞）。d -f）GBA1 mRNA表达。用于该测定法的7个PLEX探针集是定制的，旨在区分转基因特异性GBA mRNA和小鼠内源性GBA mRNA。mRNA表达值据报道为平均荧光强度（MFI）。人类GBA1 mRNA如图d -f所示。在皮质和丘脑中证明了跨大脑区域的成功转录。在肝脏中观察到降低的表达。g - i）使用Sensolote®蓝葡萄糖脑培合酶活性测定法测量皮质，丘脑和肝脏的Gcase活性。高剂量的Php.eb.gba1具有增强10、2、5和3的高剂量，在中枢神经系统组织中的GCASE活性显着增加。平均值+/- SEM。
单 AAV CRISPR 编辑非...的骨骼肌
CRISPR 基因编辑是一种治疗遗传疾病的变革性技术，但递送限制在很大程度上限制了其治疗应用到肝脏靶向和体外治疗。在这里，我们介绍了 NanoCas 的发现和工程设计，这是一种超紧凑型 CRISPR 核酸酶，能够将 CRISPR 在体内的作用范围扩展到肝脏靶标之外。我们通过实验筛选了在宏基因组数据中发现的 176 个超紧凑型 CRISPR 系统，并应用蛋白质工程方法来提高 NanoCas 的编辑效率。当通过腺相关病毒 (AAV) 载体给药时，优化的 NanoCas 在体内对各种细胞系统和组织表现出强大的编辑能力。尽管 NanoCas 的大小约为传统 CRISPR 核酸酶的三分之一，但仍能实现这一点。在概念验证实验中，我们观察到在小鼠模型中使用优化的 NanoCas 进行稳健的编辑，该模型靶向参与胆固醇调节的基因 Pcsk9，并靶向肌营养不良蛋白中的外显子剪接位点以解决杜氏肌营养不良症 (DMD) 突变。我们进一步在非人类灵长类动物 (NHP) 体内测试了我们的 NanoCas 系统的有效性，结果发现肌肉组织中的编辑水平超过 30%。NanoCas 体积小巧，结合强大的核酸酶编辑功能，为体内非肝脏组织的单 AAV 编辑打开了大门，包括使用较新的编辑模式，例如逆转录酶 (RT) 编辑、碱基编辑和表观遗传编辑。
使用Qiacuity®DigitalPCR系统
基因组滴度确定高精度。b参考标准标准（后代），并使用CGT DPCR分析在QIACINID DPCR系统上使用2个三个三重反应（ITR，CMVE，CMVP和GFP，WPRE，HGHPA）进行定量。显示了非ITR目标之间的变异系数（CV）。aav2，aAv8和aav9的目标<5％的目标之间的最大偏差<5％，<2％。C基因组完整性使用Qiacuity软件套件2.5版确定。基因组靶标在5个质子反应中运行。进行了基因组完整性的分析，包括所有5个通道或跨越基因组不同部分的2组。
开发高生产力，无纹状病毒的SF9昆虫细胞系，用于大规模AAV生产用于心血管基因疗法
ATCC衍生的SF9父母细胞系被解冻并传递，直到在适应SFRV减少的培养条件之前恢复到正常条件下恢复。通过在细胞颗粒和用过的培养基上进行基于反向转移酶（RT）PCR的测定法，常规监测培养物的生长和生存力，以及对SFRV信号的日志还原。降低SFRV 4周后，将所得培养物被镀至96孔板，而用过的培养基（未检测到RV信号后，确定的RV-无RV）用于促进克隆的生长。
一体化 AAV 表观基因组编辑平台
一体化 AAV 传递的表观基因组编辑平台：对神经退行性疾病的概念验证和治疗意义 1 2 Boris Kantor 1,2,3, †, Bernadette Odonovan 4,5, * , Joseph Rittiner 1,2,3, *, Dellila Hodgson 4,5 , Nicholas 3 Lindner 1,2,3 , Sophia Guerrero 1,2,3 , Wendy Dong 1,2,3 , Austin Zhang 1,2,3 , Ornit Chiba-Falek 4,5, † 4 5 1 神经生物学系，2 病毒载体核心，3 先进基因组技术中心，6 4 杜克大学医学院神经病学系转化脑科学部，5 基因组和 7 计算生物学中心，北卡罗来纳州达勒姆 27710，美国 8 9 10 *以下作者对稿件做出了同等贡献 11 † 通讯作者： 12 13 Ornit Chiba-Falek 14 神经病学系转化脑科学部 15 杜克大学医学院 16 美国北卡罗来纳州达勒姆 27710 17 电话：919-681-8001 18 传真：919-613-6448 19 电子邮件：o.chibafalek@duke.edu 20
影响 AAV 介导的 CRISPR 功效的因素...
频繁注射抗血管内皮生长因子 (anti-VEGF) 药物对患有新生血管性年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的患者来说是一种临床负担。使用腺相关病毒 (AAV) 递送成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)-Cas9 对 VEGF-A 进行基因组破坏有可能永久抑制异常血管生成，但决定最佳疗效的因素尚不清楚。在这里，我们研究了两种广泛使用的 Cas9 内切酶 SpCas9 和 SaCas9，并评估了 AAV 递送效率和体内基因组编辑率的相对贡献，以确定驱动基于 CRISPR 成功抑制 VEGF-A 的机制，使用激光诱导脉络膜新生血管 (CNV) 的小鼠模型。我们发现，尽管 SpCas9 的双载体方法和 SaCas9 的单载体系统在传递 Cas9 直系同源物和单个向导 RNA (gRNA) 方面的 AAV 转导效率相似，但 SpCas9 表现出比 SaCas9 更高的基因组编辑率、更大的 VEGF 减少率和更有效的 CNV 抑制。我们的结果表明，使用 AAV 介导的 CRISPR 系统成功敲低 VEGF 可能更多地取决于基因组编辑的效率，而不是病毒转导，并且 SpCas9 可能比 SaCas9 更有效，可作为基于 CRISPR 治疗新生血管性 AMD 中 CNV 的潜在治疗策略。
AAV介导的基因疗法减弱了Bardet-
Bardet-Biedl综合征（BBS）是一组遗传的常染色体隐性纤毛病，其特征是多种细胞类型中纤毛功能的干扰，导致肥胖，肾衰竭和失明。已知20多个因果基因，许多突变使BBSOME的功能是一种蛋白质复合物的功能，该蛋白质复合物调节货物蛋白在纤毛中的运动。BBS10基因中的突变是BBS的第二大原因，占所有病例的20％以上。最近，HSU等人的概念验证研究。2023，证明了在BBS10缺乏小鼠模型中使用小鼠BBS11的下接送递送的AAV基因治疗的潜力。在这项研究中，我们着手优化和识别带有人类BBS10基因的AAV8矢量，从而提供持续的功效和良好的临床翻译安全性。
AAV 载体中新型组合 microRNA 结合位点协同减少抗原呈递和转基因免疫，实现高效、稳定的转导
重组腺相关病毒 (rAAV) 平台有望用于体内基因治疗，但抗原呈递细胞 (APC) 的不良转导会削弱其应用前景，而抗原呈递细胞又会引发宿主对 rAAV 表达的转基因产物的免疫。鉴于最近接受高剂量全身 AAV 载体治疗的患者出现的不良事件，推测这些不良事件与宿主的免疫反应有关，开发抑制先天性和适应性免疫的策略势在必行。使用 miRNA 结合位点 (miR-BS) 来赋予内源性 miRNA 介导的调控，使转基因表达脱离 APC，有望降低转基因免疫力。研究表明，将 miR-142BSs 设计到 rAAV1 载体中能够抑制树突状细胞 (DC) 中的共刺激信号、减弱细胞毒性 T 细胞反应并减弱小鼠转导肌细胞的清除，从而允许在肌纤维中持续转基因表达，同时几乎不产生抗转基因 IgG。在本研究中，我们针对 26 种在 APC 中大量表达但在骨骼肌中不表达的 miRNA 筛选了单个和组合 miR-BS 设计。高免疫原性卵清蛋白 (OVA) 转基因被用作外来抗原的替代物。在成肌细胞、小鼠 DC 和巨噬细胞中进行的体外筛选表明，miR-142BS 和 miR-652-5pBS 的组合强烈抑制了 APC 中的转基因表达，但保持了成肌细胞和肌细胞的高表达。重要的是，携带这种新型 miR-142/652-5pBS 盒的 rAAV1 载体在小鼠肌肉注射后比以前的去靶向设计实现了更高的转基因水平。该盒强烈抑制细胞毒性 CTL 激活和
是由FLT201 AAV基因疗法的首次人类临床试验galileo-1
所有患者在收到FLT201后的结果进行了维护或改善。除了一名患者外，所有患者在接受FLT201后的4-11周内长期离开了他们的长期SOC（ERT/SRT）（患者5保留在SRT上）。DBS Lyso-GB1水平在基线水平升高的患者（基线平均值[范围]：185.8 ng/ml [10.3-486.4 ng/ml]; 38周平均/范围：49.8 ng/ml [12.0-172.0 ng/ml]，A 73％减少）。血红蛋白和血小板水平改善或保持在正常范围内（图2和3）。一名患者由于诊断出的铁缺乏而出现了血红蛋白的下降。启动铁补充剂后，血红蛋白水平恢复正常。肝脏和脾量得到改善或保持稳定（图4和5）。一名患者在研究进入时脾脏扩大。到第38周，该患者的脾脏量减少，现在是目标目标。
AAV 介导的青光眼和葡萄膜炎基因疗法
缩写：AAV：腺相关病毒；ABCA1：ATP 结合盒转运蛋白 A1；ACE2：血管紧张素转换酶 2；ANXA1：膜联蛋白 A1；Bcl-2：B 细胞白血病/淋巴瘤 2；Bcl-xL：超大 B 细胞淋巴瘤；BDNF：脑源性神经营养因子；Brn3b：脑特异性同源框/POU 结构域蛋白 3b；C3：C3 胞外酶转移酶；CNV：脉络膜新生血管；CS：皮质类固醇；EAU：实验性自身免疫性葡萄膜炎；ECM：细胞外基质；EIU：内毒素诱导的葡萄膜炎；HLA：人类白细胞抗原；hSyn：人类突触蛋白 1 启动子；IL-1 β：白细胞介素 1 β；IOP：眼压； IRBP：光感受器间类视黄酸结合蛋白；MAC：膜攻击复合物；MAX：MYC 相关蛋白 X；MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1；MMP：基质金属蛋白酶；Nabs：中和抗体；NF- κ B：核因子 κ B；NHP：非人类灵长类动物；NIU：非传染性葡萄膜炎；Nrf2：核因子红细胞2相关因子2；Pgk：磷酸甘油激酶；RGC：视网膜神经节细胞；RPE：视网膜色素上皮；scAAV：自互补 AAV；sCD59：可溶性 CD59；SOD2：超氧化物歧化酶 2；Tg-MYOC Y437H：具有肌动蛋白 Y437H 突变的转基因小鼠；TLR：Toll 样受体；TM：小梁网； TrkB：原肌球蛋白相关受体激酶-B；VEGF：血管内皮生长因子