特征选择、层次聚类和差异表达分析确定了细胞类型标记基因。将其他感兴趣的目标与细胞类型标记列表相结合,得到总共 500 个基因。BD WTA-to- poly( A ) 流程选择了基因列表的主要转录本变体,并创建了终止于 poly( A ) 位点的转录本最后 1,000 个碱基的 FASTA 文件。FASTA 文件输入到 BD Genomics Resource 上的引物设计工具中。引物设计流程通过评估各种因素(例如熔化温度、扩增子长度、引物兼容性和目标特异性)输出一组引物。由此产生的定制 500 基因面板包含细胞类型标记和与肾脏生理学和器官重塑有关的感兴趣的基因的组合。
GenoScreen 拥有基于新一代测序 (NGS) 的试剂盒,可同时识别分枝杆菌种类、进行基因分型并预测结核分枝杆菌复合群 (MTBC) 菌株的耐药性;该试剂盒 (Deeplex® Myc-TB) 可直接用于临床样本 (1) 。该检测依赖于单个 24 重扩增子混合物的深度测序,针对与一线和二线抗结核药物(利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氟喹诺酮类、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、链霉素、乙硫异烟胺、贝达喹啉、氯法齐明和利奈唑胺)耐药性相关的 18 个主要 MTBC 基因区域。 hsp65 基因是分枝杆菌种属识别的靶标,而 spoligotyping 靶标(CRISPR/直接重复 [DR] 基因座)和耐药相关靶标中的系统发育单核苷酸多态性 (SNP) 用于 MTBC 菌株基因分型。
1. Illumina 测序: • 原理:使用可逆终止子进行合成测序。 • 主要特点:高准确度、短读长、高通量和成本效益。 应用:全基因组测序、外显子组测序、RNA 测序等。 2. Ion Torrent 测序: 原理:检测 DNA 合成过程中释放的氢离子。 主要特点:速度快、适合靶向测序和台式仪器。 应用:靶向测序,包括癌症面板和扩增子测序。 3. PacBio 测序(SMRT 测序): • 原理:在合成过程中实时观察 DNA 聚合酶。 • 主要特点:长读长、能够捕获结构变异。 • 应用:从头基因组组装、全长 RNA 测序和表观遗传学研究。
研究人员经常依靠Silico CRISPR计算设计算法来产生高性能的GRNA,但仍会在体内经历编辑故障。我们的另一个客户就是这种情况,一个研究团队开发了转基因无菌男性蚊子来打击疟疾的传播。他们的基因编辑实验经常失败,导致大量延迟,每个失败的实验都将项目恢复了8到12个月。在此问题上与他们合作,我们使用CRISPR Analytics平台来量化两个GRNA候选者的扩增子裂解活性。数据表明,两个GRNA都表现出裂解活性在远高于阴性对照的水平上,其中一个GRNA显示出大约是另一个活性的两倍(图2A)。
EnGen 突变检测试剂盒提供用于检测靶向基因组编辑事件的试剂。第一步,使用 Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix 扩增基因组被靶向的细胞(即 CRISPR/Cas9、TALEN、锌指核酸酶)的目标区域。变性和重新退火后,当扩增子池中存在插入和缺失 (indel) 突变时,会形成异源双链。第二步,退火的 PCR 产物用 EnGen T7 核酸内切酶 I 消化,这是一种结构特异性酶,可识别大于 1 个碱基的错配。当存在错配时,DNA 的两条链都会被切断,从而形成较小的片段。对所得片段的分析可以估计基因组编辑实验的效率。
ENGEN突变检测试剂盒提供了用于检测目标基因组编辑事件的试剂。在第一步中,使用Q5热启动High-Fidelity 2X Master Mix放大了来自基因组的靶向区域(即CRISPR/CAS9,TALES,锌指核酸酶)。在变性和重新进行重新进行后,当插入和缺失(Indels)中存在于扩增子池中时,就会形成异质化合物。在第二步中,将退火的PCR产物用Engen T7核酸内切酶I消化,这是一种特定于结构的酶,将识别大于1碱基的不匹配。存在不匹配时切割DNA的两个链,从而导致形成较小的片段。对所得片段的分析提供了基因组编辑实验效率的估计。
摘要 CRISPR/Cas9 技术是设计基因驱动系统以控制和/或改变蚊媒种群的有力工具;然而,CRISPR/Cas9 介导的非同源末端连接突变可能对产生抗驱动的等位基因产生重要影响,从而对驱动效率产生重要影响。我们展示并比较了两种技术在疟疾媒介蚊子斯氏按蚊中的插入或缺失 (indel) 检测能力:扩增子分析插入缺失检测 (IDAA™) 和液滴数字™ PCR (ddPCR™)。这两种技术在含有不同比例和不同大小的插入缺失的蚊子样本中都显示出插入缺失频率的准确性和可重复性。此外,这些技术具有优势,使它们可能更适合在基因驱动蚊子的笼养试验和封闭式现场测试中进行高通量非同源末端连接分析。
使用NF核心工作流程的NF核/Ampliseq版本2.8.0进行了使用,利用Bioconda和Biocontainers项目的可重复的软件环境[35-38]。使用FASTQC(版本0.12.1)评估数据质量,并用MultiQC(版本1.18)进行汇总[39]。序列,以消除Phix污染,修剪读数(以275 bp为单位读取和265 bp的反向读数;丢弃的读数短于265 bp),以> 2的预期错误,以更短的读数,以纠正错误,以纠正poirors real paie paik&remoge paik&remoge paike&删除paike&remaas chimeras chimeras chimeras chimeras。最终,在所有样品中获得了3880个扩增子测序变体(ASV)[40]。保留了每个样品读数的29.81%和44.06%(平均36.8%)。ASV计数表包含
J.,Grochowalski,。,Strapagiel,D.,Gnat,S.,Załuski,D.,Gancarz,M.,Rusinek,R.,Krutmuang,P.,MartínHernánandez,R.对来自真菌和植物的细菌及其2个区域的可变16S rRNA的扩增子测序,使蜜蜂对疾病的易感性重新易感性,这是由于其在人为景观下的饲料可用性而引起的。病原体,10,381。https://doi。Org/10. 3390/Patho Gens1 0030381 R Core Team。(2022)。r:用于统计计算的语言和环境。r统计计算基础。https://www.r- proje ct。(2018)。肠道微生物组在