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摘要：现代生物学，尤其是合成生物学，在很大程度上依赖于DNA元素的结构，通常是以质粒的形式进行的。质粒用于多种应用，包括用于随后纯化的蛋白质的表达，用于生产有价值化合物的异源途径的表达以及对生物学功能和机制的研究。对于所有应用，构建质粒后的关键步骤是其序列验证。传统的序列确定方法是Sanger测序，每反应限制约为1000 bp。在这里，我们提出了一种高度可扩展的内部方法，用于使用长阅读纳米孔测序快速验证放大的DNA序列。我们开发了两步扩展和转座酶策略，为双条形码测序提供了最大的灵活性。我们还提供了一个自动分析管道，以快速可靠地分析测序结果，并为每个样本提供易于解释的结果。用户友好的duba.Flow开始到虚拟管道广泛适用。此外，我们表明，使用duba.Flow的构造验证可以通过条形码菌落PCR扩增子测序进行，从而加速了研究。关键字：合成生物学，长阅读测序，DNA构造验证，菌落PCR，实验室自动化，双条形码扩增子测序■简介
定义转染的疟原虫中载体吸收的多样性
恶性疟原虫中耐药性的复发性出现增加了遗传验证耐药性机制并确定新靶标的紧迫性。反向遗传学促进了基因组规模的基因敲除筛网和弓形虫弓形虫的基因组规模的敲除筛选，其中多个向量的合并转染对于增加规模和吞吐量至关重要。这些方法尚未在人类疟疾物种（如恶性疟原虫和诺尔斯氏菌）中实施，部分原因是在这些物种中可以进行合并转染的程度尚待评估。在这里，我们使用下一代测序来定量摄取94个条形码向量的池。载体采集的分布使我们能够估计寄生虫种群所取的条形码和DNA分子的数量。恶性疟原虫转染物的稀释克隆表明，单个克隆具有多达七个偶发性条形码，表明尽管转染效率低下，多个载体的摄入量经常发生。对三个光谱呈现的荧光记者的转染使我们能够评估不同的转染方法，并发现Schizont阶段转染限制了寄生虫接收多个向量的趋势。与恶性疟原虫相比，我们观察到，诺尔斯氏菌的较高转染效率导致文库几乎完全表示。这些发现对如何在可培养的质量物种中缩放反向遗传学具有重要意义。
对遗传上不同的恶性疟原虫菌株进行条形码编码，以比较评估其适应性和抗疟药物耐药性
摘要 恶性疟原虫对抗疟药物（包括目前最前沿的抗疟药物青蒿素）的耐药性不断出现，是疟疾控制的一个长期问题。下一代测序大大加速了耐药性相关基因多态性的鉴定，但也凸显了需要更灵敏、更准确的实验室工具来分析现在和未来的抗疟药物，并量化耐药性获得对寄生虫适应度的影响。适应度和药物反应之间的相互作用对于理解为什么特定的遗传背景更能推动自然种群中耐药性的进化至关重要，但寄生虫适应度状况对耐药性流行病学的影响通常很难在实验室中准确量化，因为检测的准确性和通量有限。这里我们提出了一种可扩展的方法来分析基因上不同的恶性疟原虫菌株的适应度和药物反应，这些菌株对几种抗疟药的敏感性有很好的描述。我们利用 CRISPR/Cas9 基因组编辑和条形码测序来追踪整合到非必需基因 (pfrh3) 中的独特条形码。我们在三种具有不同地理来源的菌株的多重竞争性生长测定中验证了这种方法。此外，我们证明这种方法可以成为一种追踪青蒿素反应的有力方法，因为它可以在多种寄生虫系混合物中识别出青蒿素抗性菌株，这表明了一种在条形码寄生虫系文库中扩展费力的环状阶段存活率测定的方法。总的来说，我们提出了一种新颖的高通量方法，用于多重竞争性生长测定来评估寄生虫的适应度和药物反应。
植物单细胞基因调控网络
图 1 单细胞测序分析的一般工作流程。（a）通过分离原生质体（小绿圈）将组织或器官解离成单个细胞；（b）将原生质体装入封装单个原生质体（小绿圈）的微流体系统中，其中试剂用于标记具有不同条形码（较大的多色圆圈）的转录本，所述条形码可识别转录本来源的细胞，也可以通过此过程添加其他条形码，例如 UMI；（c）然后汇集带条形码的转录本并使用短读技术进行测序；（d）然后处理测序读取以根据文库制备期间添加的条形码序列将每个转录本分配给来源细胞； (e) 所有细胞的转录组都经过降维（例如 tSNE 或 UMAP），其中具有相似转录组谱的细胞将在二维空间中绘制得更紧密，而具有不太相似转录组的细胞将绘制得更远，并且可以通过算法识别具有相似转录组的细胞簇。在此示例中，图上的每个点代表一个细胞，点的颜色代表该细胞被分配到的簇。（f）细胞簇可以根据已知标记基因的丰度或与已建立细胞类型的转录组的整体相似性被表征为已知细胞类型；如果没有已知标记与观察到的转录组谱相匹配，细胞簇也可以被描述为未知的或新的。在此示例中，重建组织中的细胞被着色以反映图 (e) 中识别的假设转录组簇
DNA条形码对生物多样性数据的贡献
昆虫是地球上种类最丰富的群体之一。它们构成了许多动物多样性，并在生态系统中起着至关重要的作用，包括授粉，害虫控制和分解。但是，仅描述了这种多样性的一部分。南非被认为是全球生物学上最多样化的国家之一，估计有44,000种昆虫物种。许多农作物依赖于昆虫传粉媒介，包括菜籽，苹果，橘子和向日葵。目前缺乏野生传粉媒介会威胁农作物的产量，但我们对南非昆虫多样性的了解却很少。相对于南非的生物多样性，几乎没有分类专家，用于昆虫识别的方法可能是耗时且昂贵的。DNA条形码为加速昆虫生物多样性研究提供了重要的研究工具。在这篇综述中，我们询问了公共DNA条形码粗体（生命数据系统的条形码）数据库中的“昆虫”记录，并返回了416 211个已发表的记录，分配给28239个独特的垃圾箱（条形码指数编号）。我们确定了五个分类订单，其垃圾箱比南部非洲已知的物种多（膜翅目，双翅目，thysanoptera，plecoptera和strepsiptera）。大多数条形码记录均来自豪登省，姆普马兰加和林波波的不适陷阱采样，而南非其他地区的采样仍然很差。我们建议需要进行全面的国家抽样努力，以及对分类专业知识的投资增加，以在物种遗失以灭绝之前生成有关昆虫生物多样性的关键基线数据。
沙门氏菌血清鼠伤寒沙门氏菌的定量...
抽象的鼠模型通常用于研究肠道病原体肠typhimurium的致病性和传播。在这里，我们量化了s。使用StampR分析管道和高度多样的小鼠中的小鼠中的伤寒人群动力学。typh- imurium barcod的文库，包含约55,000个独特的菌株，可通过枚举s来区分基因组条形码。伤寒创始人群和小鼠传播的解密途径。我们发现，严重的瓶颈只允许口服接种物中的一百万个细胞中的一个人在肠道中建立一个小众。此外，我们观察到整个肠道中病原体种群的分室化，肠段和粪便之间几乎没有条形码。链霉素治疗后这种严重的瓶颈扩大和分室化降低，这表明微生物群在限制病原体的定植和肠内运动中起关键作用。此外，在肠道和局部器官种群之间存在最小的共享，表明向肠外部位传播迅速发生，直到肠道大量病原体扩张。通过静脉注射或腹膜内注射通过接种小鼠来绕过肠道瓶颈，发现沙门氏菌在至少两种不同的途径中在肠外部位建立壁nir后将肠子重新进入肠。一条途径导致多样化的肠道种群。在一起，这些发现加深了我们对沙门氏菌种群动态的理解。另一种重生途径是通过胆汁，病原体通常是克隆的，导致克隆肠种群，并与胆囊病理相关。
基于高通量测序的中和测定法揭示了重复的疫苗接种如何影响滴度对最近的人类H1N1流感菌株
摘要流感病毒的高遗传多样性意味着传统的血清学测定太低，无法测量针对所有相关菌株的血清抗体中和滴度。为了克服这一挑战，我们开发了一种基于测序的中和测定法，该测定法使用类似于传统的中核测定法的工作流量，同时使用小血清体积来测量许多病毒菌株。关键创新是将独特的核苷酸条形码纳入血凝素（HA）基因组段，然后使用许多不同的条形HA变体池病毒，并使用下一代测序同时量化所有这些病毒。使用这种方法，一位研究人员在大约1个月内进行了2,880种传统中和测定（80例血清样品对36个病毒菌株）。我们应用了基于测序的测定法，以量化流感疫苗接种对中和滴度对最近或尚未接受过疫苗疫苗的个体中和H1N1菌株的影响。我们发现，疫苗接种引起的中和抗体的病毒应变特异性在个体之间有所不同，并且疫苗接种导致上一年也接受过疫苗的个体的滴度较小，尽管在接受和没有上年疫苗接种的个体中疫苗接种后6个月相似。，即使在疫苗接种后，我们还确定了近期H1N1的一个子集的一部分。我们提供实验性Pro tocol（dx.doi.org/10.17504/protocols.io.kqdg3xdmpg25/v1）和计算管道（https://github.com/jbloomlab/jbloomlab/seqneut-pipeline）用于基于测序基于序列的中核中源的方法，以其他方法来衡量该方法的其他方法。
综合分类学之旅揭示马来西亚水域海洋鱼类多样性、新记录和隐蔽物种
本研究采用 DNA 条形码和形态学鉴定相结合的综合方法，阐明了马来西亚半岛 (PM) 专属经济区 (EEZ) 海洋鱼类的物种多样性。我们的重点是南海 PM 东海岸进行的底栖调查。我们重新评估了 16 个目和 41 个科的 93 个假定物种（92 个条形码形态种）的 475 个标本的多样性，其中包括两个 IUCN 易危物种。总共有两个物种 - Saurida isarankurai 和 Oxyurichthys auchenolepis - 作为新记录呈现，三个物种 - Nemipterus balinensoides、Gymnothorax reevesii 和 Synodus hoshinonis - 作为马来西亚水域的第一批基于标本的记录。细胞色素 c 氧化酶亚基 I ( COI ) 序列分析划定了 95 个一致的分子操作分类单位 ( MOTU )，超过了形态多样性。有趣的是，条形码分析显示，在一种形态上已鉴定的鱼类物种内存在几种 MOTU，种内和种间的遗传分歧均超过 2%，这表明物种群内存在相当大的种内遗传分歧，或者我们的数据集内存在形态上隐蔽的物种。这些发现凸显了物种划界的复杂性和遗传方法的价值。我们的研究为了解马来西亚半岛东海岸的海洋鱼类多样性提供了宝贵的见解，并通过 DNA 条形码增进了我们对生态系统的遗传多样性、分布和保护需求的理解。通过将 DNA 条形码与形态学相结合，我们为未来制定马来西亚海洋生物多样性保护和管理战略的研究提供了一个全面的框架。本研究生成的遗传条形码数据库的扩展将促进未来的分子分类学研究。
深层曲目开采发现靶向多种峰值表位的超大冠状病毒中和抗体
- Bryan Briney（Briney@scripps.edu）-Wyatt J. McDonnell（通讯@10xgenomics.com）摘要开发疫苗和治疗剂的开发，这些疫苗和治疗剂对已知和新兴的冠状病毒广泛有效，这是紧迫的优先事项。当前开发泛病毒对策的策略主要集中在冠状病毒尖峰蛋白的受体结合结构域（RBD）和S2区域。目前尚不清楚N末端结构域（NTD）是否是通用疫苗和广泛中和抗体（ABS）的可行靶标。此外，许多靶向RBD的ABS已被证明容易受病毒逃生的影响。我们使用多重的单位杆编码抗原在高通量单细胞工作流程中筛选了Covid-19幸存者和疫苗的循环B细胞库，以分离9,000多个SARS-COV-2-特异性单氯基ABS（MABS），从而使SARS-COV-COV-COV-2 SPECICIDIC ABSEIDICABERIDIC ABSIDICIDICABSIFICICADEIDIC。我们观察到个体之间的许多克隆聚结的实例，这表明AB反应经常在相似的遗传溶液上独立汇聚。在回收的抗体中是TXG-0078，这是一种公共中和的mAB，它结合了冠状病毒尖峰蛋白的NTD超级站点，并识别出多种α-和β-核纳病毒的收集。TXG-0078实现了其出色的结合宽度，同时利用相同的VH1-24可变基因特征和重型链的结合模式在其他NTD超级特异性特异性中和中和腹肌中可见，具有较窄的特异性。我们还报告了CC24.2的发现，CC24.2是一种泛核病毒中和MAB，它针对新型的RBD表位，并针对所有测试过的SARS-COV-2变体（包括BQ.1.1.1和XBB.1.5）显示出相似的中和效力。 TXG-0078和CC24.2的鸡尾酒提供了针对SARS-COV-2的体内挑战的保护，这表明将来可能在耐种的治疗性AB鸡尾酒中使用，作为泛环病毒疫苗设计的模板。我们还报告了CC24.2的发现，CC24.2是一种泛核病毒中和MAB，它针对新型的RBD表位，并针对所有测试过的SARS-COV-2变体（包括BQ.1.1.1和XBB.1.5）显示出相似的中和效力。TXG-0078和CC24.2的鸡尾酒提供了针对SARS-COV-2的体内挑战的保护，这表明将来可能在耐种的治疗性AB鸡尾酒中使用，作为泛环病毒疫苗设计的模板。
Roseinatronobacter sp。完整的基因组序列。菌株S2，一种从pH 12蛇形化系统中分离出的化学硫代表营养
s2是从山的Ney Springs中分离出来的Shasta，加利福尼亚州，在最小培养基板上，其中包含20 mM多硫化物和10毫米乙酸盐（6）。S2在含有20 mm硫代硫酸盐和10 mm乙酸盐的液体最小培养基中进行有氧培养。详细的媒体说明可在此处找到：dx.doi.org/10.17504/protocols.io.bqjgmujw。S2在室温下孵育5天，以实现由先前的生长曲线确定的近似最大浊度（6）。DNA，并使用量子荧光计（美国Thermofisher Scientific，USA）进行定量。所有测序均由单个DNA准备。纳米孔库在高智能模式（280 bp/s）下使用R10.4.4的流动池（FLO-MIN114）用天然条形码24 V14试剂盒（牛津纳米孔技术，英国牛津，英国）进行测序。用孔雀鱼V.6.4.6进行，删除了质量分数<7的读数（7）。 在Seqcenter LLC（美国匹兹堡，美国）进行了 Illumina库准备和测序。 简要地，使用Illumina DNA准备套件制备库，并用10 bp独特的双指数进行条形码，并在Illumina Novaseq（2×150个测序）上进行测序。 使用BCL-Convert（v.4.0.3）进行反复式，质量控制和适配器修剪。 纳米孔序列> 2,000 bp用菲尔隆（V.0.2.1）（8）过滤质量，并去除了最差的10％的读取碱基。 过滤的长读数与Flye组装（v.2.9.1）（9）。 进行了四轮抛光。 质量评估和基因组统计数据，删除了质量分数<7的读数（7）。Illumina库准备和测序。简要地，使用Illumina DNA准备套件制备库，并用10 bp独特的双指数进行条形码，并在Illumina Novaseq（2×150个测序）上进行测序。使用BCL-Convert（v.4.0.3）进行反复式，质量控制和适配器修剪。纳米孔序列> 2,000 bp用菲尔隆（V.0.2.1）（8）过滤质量，并去除了最差的10％的读取碱基。过滤的长读数与Flye组装（v.2.9.1）（9）。进行了四轮抛光。质量评估和基因组统计数据Illumina读取的质量是用FastQC（v.0.12.1）（10）过滤的，所有读取的质量得分> Q30。简短的读数与Burrows -wheeler对准器（V.0.7.17）（11）对齐，并用Pilon（V.1.24，-fix all）（12）抛光组件。