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crispr-cas9：超越生殖系的生物伦理争论
CRISPR-Cas9 系统在其自然状态下被认为是细菌和古菌中存在的一种抵抗噬菌体再感染的免疫形式 (2)；而在其人工形式下，它是一种设计简单、使用简单、效率高的基因编辑工具 (10)。 1987 年，通过对大肠杆菌（Escherich, 1885）的核苷酸进行测序，首次发现了后来被称为 CRISPR 区域的重复同源 DNA 序列（11）。 21世纪初，它的一些生物学功能被确定（12），然后，这些区域与一组Cas基因相关。 2005 年和 2007 年，这些回文结构针对病毒再感染的免疫作用得到了实验验证（13），一年后，指导抗病毒防御的 RNA 链（crRNA）的参与被联系起来（14）。 CRISPR-Cas9 的基本成分主要在化脓性链球菌 (Rosenbach 1884) 中被描述，这要归功于 Doudna 和 Charpentier (1) 的工作，他们当时建议通过重新设计 Cas9 复合物将其用作基因组编辑工具。后
人类 T 细胞的大规模并行敲入工程
靶向基因敲入在细胞治疗中的应用效率普遍较低，规模有限。本研究开发了CLASH系统，该系统能够实现高效、高通量的基因敲入工程。在CLASH中，Cas12a/Cpf1 mRNA与混合腺相关病毒结合，通过大规模并行同源定向修复介导同时基因编辑和精准转基因敲入，从而产生一个稳定整合的突变变体池，每个变体都具有靶向基因编辑功能。我们将该技术应用于原代人T细胞，并使用CD3、CD8和CD4 T细胞在血癌和实体瘤模型中进行了时间进程式CLASH实验，从而实现了有利的CAR-T变体的混合生成和无偏选择。 CLASH 实验中出现了一种独特的 CRISPR RNA (crRNA)，它可以在 CAR-T 中生成 PRDM1 的外显子 3 跳跃突变，从而增强这些细胞的增殖、干细胞样特性、中枢记忆和寿命，从而在多种癌症模型（包括实体瘤模型）中提高体内疗效。CLASH 的多功能性使其广泛应用于各种细胞和治疗工程应用。
CRISPER-CAS系统及其应用
摘要 CRISPR-Cas 专注于许多细菌和几乎所有古细菌的适应性免疫系统。它的发现证明了它是一种简单的工具，并且在许多方面都有效，例如转录激活因子。它可用于在单个事件中同时添加所需等位基因并去除不需要的等位基因。目前，CRISPR-Cas 已成为一种工程工具，用于控制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酿酒酵母等许多生物体的遗传改造。CRISPR-Cas9 系统因其易于构建的实验室和针对多个基因组位点而彻底改变了基因组编辑领域。Cas9 酶已被用作医学研究领域中定向基因编辑的流行工具。它可以用作各种无法治愈的遗传疾病的有效基因治疗方法。它主要用于微生物适应性免疫系统、基因调控、功能基因组学、基因组编辑、关键词：基因组编辑、CRISPR-Cas 收到日期 2020 年 5 月 21 日 修订日期 2020 年 6 月 15 日 接受日期 2020 年 7 月 23 日 简介 1970 年，重组 DNA 技术的发展标志着生物学新时代的开始。分子生物学家获得了操纵生命“DNA”蓝图的能力，从而可以研究基因和利用新型药物。它为我们提供了一种通过在目标位点插入或删除基因来获得基因组中所需变化的方法。CRISPER 就是这样一种新型分子工具的发展。成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPER)/CRISPER 相关 (Cas) 系统存在于许多细菌和几乎所有古菌中，并构成一种适应性免疫系统，通过识别噬菌体和质粒然后降解它们的 DNA 来保护它们免受侵害[1]。 Barrangou 等人对这种免疫机制的基本认识是他们提出的，他们表明嗜热链球菌可以通过将传染性病毒的基因组片段整合到其 CRISPER 基因座中来获得对噬菌体的抗性。[2] 几乎所有细菌基因组都有 CRISPER-Cas9 基因座。这些基因座由成簇的直接回文重复序列组成，每个重复序列后面都是先前暴露于外来 DNA 的短片段间隔 DNA [3][4]。重复序列通常长 28 到 37 个核苷酸，在单个基因座中是相同的。散在的核苷酸序列称为间隔，来自外来病毒。间隔序列转录为 CRISPERRNA (crRNA)。CRISPER 基因座还包含编码互补反式激活 Crisper RNA (tracrRNA) 的 DNA 序列和编码核酸酶的各种 Crisper 相关基因 (cas)。这些 crRNA 与互补反式激活 Crisper RNA (tracrRNA) 杂交，并作为双链一起识别互补的外来核苷酸序列。
人类基因组中的伦理争议和挑战...
1993年弗朗西斯科·莫吉卡（Francisco Mojica）等。1,5）发现了现在被称为“定期散布短的短质体重复的群集”（CRISPR）。Jinek等。 2,5）在2012年将CRRNA和曲克纳分子组合成单个RNA的唯一分子。 通过Crisper-Cas9系统3,5）促进了哺乳动物细胞中成功的基因组编辑。 在人类基因组中，该系统在2013年3 - 5年成功重复。 Liang等。 6）2015年宣布，CRISPR-CAS9基因编辑技术用于首次修改人类胚胎的DNA序列6,7）。 CRISPR-CAS9已成为人类工程领域的游戏规则改变者8,9）。 该系统具有卓越的功效，优越的安全性，更精确，受欢迎，具有经济利益，并且很容易获得获得结果。 该技术使用酶7）而不是病毒来改变DNA。 随着CRISPR-CAS9的利用迅速增加，它为基因编辑带来了高水平的破坏8-12）研究和伦理格局。 关注，争议和挑战在人类基因组编辑中的整个道德格局中产生。Jinek等。2,5）在2012年将CRRNA和曲克纳分子组合成单个RNA的唯一分子。通过Crisper-Cas9系统3,5）促进了哺乳动物细胞中成功的基因组编辑。在人类基因组中，该系统在2013年3 - 5年成功重复。Liang等。 6）2015年宣布，CRISPR-CAS9基因编辑技术用于首次修改人类胚胎的DNA序列6,7）。 CRISPR-CAS9已成为人类工程领域的游戏规则改变者8,9）。 该系统具有卓越的功效，优越的安全性，更精确，受欢迎，具有经济利益，并且很容易获得获得结果。 该技术使用酶7）而不是病毒来改变DNA。 随着CRISPR-CAS9的利用迅速增加，它为基因编辑带来了高水平的破坏8-12）研究和伦理格局。 关注，争议和挑战在人类基因组编辑中的整个道德格局中产生。Liang等。6）2015年宣布，CRISPR-CAS9基因编辑技术用于首次修改人类胚胎的DNA序列6,7）。CRISPR-CAS9已成为人类工程领域的游戏规则改变者8,9）。该系统具有卓越的功效，优越的安全性，更精确，受欢迎，具有经济利益，并且很容易获得获得结果。该技术使用酶7）而不是病毒来改变DNA。随着CRISPR-CAS9的利用迅速增加，它为基因编辑带来了高水平的破坏8-12）研究和伦理格局。关注，争议和挑战在人类基因组编辑中的整个道德格局中产生。
lbcas12a介导的棉叶卷曲的抑制作用
begomovirus具有传染性，并且严重影响了商业上重要的食物和粮食作物。棉叶卷曲的木木病毒（Clcumuv）是巴基斯坦棉花病毒最主要的特征之一，是对棉花产量的主要限制。目前，植物基因组编辑领域正在通过CRISPR/CAS系统应用（例如基础编辑，主要编辑和基于CRISPR的基因驱动器）进行革命。CRISPR/CAS9系统已成功用于模型和作物植物中的概念概念研究，以针对生物和非生物植物应力。CRISPR/CAS12和CRISPR/CAS13最近已在植物科学中应用于基础和应用研究。在这项研究中，我们使用了一种新型的方法，基于CRRNA的CAS12A工具箱，同时在多个位点靶向Clcumuv基因组的不同ORF。这种方法成功地消除了烟熏本尼亚娜和烟草的症状。从Clcumuv基因组设计了三个单独的CRRNA，针对四个不同ORF（C1，V1和C2和C3重叠区）的特定位点。基于CAS12A的构建体Cas12a-MV是通过金门三向克隆设计的，用于精确编辑Clcumuv Genome。cas12a-MV构建体是通过使用引物UBI-Intron-F1和M13-R1的整个基因组测序来确认的。通过农业纤维化方法，在4周大的尼古蒂亚纳本田植物中进行了瞬态测定。sanger测序表明，CAS12A-MV构建体在病毒基因组的靶位点上产生了相当大的突变。此外，对Sanger测序结果的潮汐分析显示了CRRNA1（21.7％），CRRNA2（24.9％）和CRRNA3（55.6％）的编辑效率。此外，Cas12a-MV构建体通过叶盘方法稳定地转化为烟草Tabacum，以评估转基因植物对Clcumuv的潜力。进行转基因分析，对烟草的转基因植物的DNA进行了PCR，以扩大具有特定底漆的Cas12a基因。传染性克隆在感染性测定中的转基因和非转基因植物（对照）中被农民接种。与具有严重症状的对照植物相比，含有Cas12a-MV的转基因植物表现出少数症状，并且保持健康。与对照植物相比，含有CAS12A-MV的转基因植物显示出病毒积累的显着降低（0.05）（1.0）。结果表明，多重LBCAS12A系统的潜在用途在模型和作物植物中针对贝诺维病毒中发展病毒抗性。
cas12b（A.酸性）重组
描述：重组A.酸性AAPCAS12B（V型CRISPR相关蛋白CAS12B），无标签。AAPCAS12B属于V型CRISPR效应器CRISPR-CAS12B/C2C1，对于广泛的应用，高温。物种：酸性酸性酸性构建体：CAS12B（全长）（酸性）浓度：0.20 mg/ml表达系统：大肠杆菌纯度：80％格式：水缓冲液溶液。以：50 mm磷酸钠，pH 7.5、300 mm NaCl，1 mM DTT和10％甘油MW：128 kDa GenBank登录：WP_067623834稳定性：至少在-80°C时至少6个月。存储：-80°C使用的说明：在冰上解冻，并在使用前轻轻混合。不要涡旋。在打开前进行快速旋转。等分的小容量，然后闪烁冻结以进行长期存储。避免多个冻结/解冻周期。测定条件：使用基于CRISPR的荧光记者测定法测量了不同量的AAPCAS12B活性，以获得最佳结果。使用RNA引导的DNA与CAS12结合，将靶DNA切割和不加选择的单链DNA侧支裂解激活。荧光信号的发射是由于裂解后ssDNA记者的降解所致。Active Cas12 was thawed on ice while 1X Endonuclease Buffer containing 10 mM Tris- HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , and 0.1 mg/ml BSA, guide RNA (custom designed crRNA), ds DNA activator (complementary sequence to crRNA and a PAM sequence specific for Cas enzyme) and FQ-ssDNA substrate （用荧光团和淬火器标记）平衡为室温。然后将板密封并在37°C下孵育10-30分钟。使用1X内核酸酶缓冲液制备了活性CAS12（4倍最终浓度）指南RNA（4倍最终浓度）和含有DS DNA激活剂和SSDNA报告基因（2倍最终浓度）的激活器/报告剂混合物（2倍最终浓度）。10 µL的4倍活性CAS12和10 µL的4倍引导RNA在室温下在固体黑色96井板的一半面积中预孵育10分钟。预孵育后，将20 µL的2倍激活剂/报告基因混合物添加到板上，并将其放置在振动孵化器上1分钟。然后将板平衡至室温，去除板密封剂，并在毫用读取器上读取荧光。阴性对照是通过用相等量的测定缓冲液代替酶工作溶液来测量的。应用程序：
Alt-R HDR 设计工具和 HDR 供体寡核苷酸
图 1.与其他修饰相比，具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 图 1.与其他修饰相比，具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 （A）供体寡核苷酸修改的示意图。 （B）每次修改的 HDR 效率。使用 4D-Nucleofector™ 系统（Lonza）将四个靶向基因位点的 RNP 复合物（2 µM）与 0.5 µM 单链 HDR 供体寡核苷酸通过电穿孔共转染到 Jurkat 和 HeLa 细胞中。使用的 RNP 复合物是 Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3，以及 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 和 tracrRNA。 使用了三种类型的供体寡核苷酸：未经任何修饰的寡核苷酸（未修饰的）、具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸（PS 修饰的）和具有 Alt-R HDR 修饰的寡核苷酸（Alt-R HDR 修饰的）。 电穿孔后 48 小时 (HeLa) 或 72 小时 (Jurkat) 提取基因组 DNA。通过在 Illumina™ MiSeq™ 系统 (v2 化学、150 bp 双端读取) 上进行扩增子测序来测量 HDR 效率。
基于工程双组分向导 RNA 的分子接近传感器
合成生物学的目标之一是能够设计具有可编程输入和输出的任意分子电路。此类电路将电子电路和自然电路的特性结合起来，以可预测的方式在活细胞内处理信息。基因组编辑是合成分子电路的潜在强大组成部分，无论是用于调节目标基因的表达还是用于将信息稳定地记录到基因组 DNA 中。然而，将蛋白质-蛋白质相互作用或诱导接近等分子事件编程为基因组编辑的触发因素仍然具有挑战性。在这里，我们展示了一种称为“P3 编辑”的策略，它将蛋白质-蛋白质接近与功能性 CRISPR-Cas9 双组分向导 RNA 的形成联系起来。通过设计 crRNA：tracrRNA 相互作用，我们证明了各种已知的蛋白质-蛋白质相互作用以及化学诱导的蛋白质结构域二聚化可用于激活人类细胞中的原始编辑或碱基编辑。此外，我们还探索了 P3 编辑如何整合基于 ADAR 的 RNA 传感器的输出，从而可能允许特定 RNA 在更大的电路中诱导特定的基因组编辑。我们的策略增强了基于 CRISPR 的基因组编辑的可控性，有利于其在活细胞中部署的合成分子回路中的应用。
基于工程双组分向导 RNA 的分子接近传感器
合成生物学的目标之一是能够设计具有可编程输入和输出的任意分子电路。此类电路将电子电路和自然电路的特性结合起来，以可预测的方式在活细胞内处理信息。基因组编辑是合成分子电路的潜在强大组成部分，无论是用于调节目标基因的表达还是用于将信息稳定地记录到基因组 DNA 中。然而，将蛋白质-蛋白质相互作用或诱导接近等分子事件编程为基因组编辑的触发因素仍然具有挑战性。在这里，我们展示了一种称为“P3 编辑”的策略，它将蛋白质-蛋白质接近与功能性 CRISPR-Cas9 双组分向导 RNA 的形成联系起来。通过设计 crRNA：tracrRNA 相互作用，我们证明了各种已知的蛋白质-蛋白质相互作用以及化学诱导的蛋白质结构域二聚化可用于激活人类细胞中的原始编辑或碱基编辑。此外，我们还探索了 P3 编辑如何整合基于 ADAR 的 RNA 传感器的输出，从而可能允许特定 RNA 在更大的电路中诱导特定的基因组编辑。我们的策略增强了基于 CRISPR 的基因组编辑的可控性，有利于其在活细胞中部署的合成分子回路中的应用。
基于共编辑1策略2的T0代植物高效无转基因基因组编辑
对 T0 代植物进行无转基因基因组编辑是人们非常希望实现的目标，但同时也极具挑战性，尤其是在多年生植物和无性繁殖植物中。在这里，我们研究了通过农杆菌介导的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE)/gRNA-Cas12a/crRNA-GFP 在植物体内瞬时表达来生成无转基因基因编辑植物的共编辑策略。具体而言，12 CBE/gRNA 用于碱基编辑 ALS 基因，从而赋予对除草剂氯磺隆的抗性，作为 13 选择标记，该抗性对植物表型没有负面影响；Cas12a/crRNA 用于编辑感兴趣的基因；GFP 用于选择无转基因转化子。使用 15 这种方法，可以在 T0 代中高效地针对番茄、烟草、马铃薯和柑橘中的各种基因 16 (单个或多个) 生成无转基因基因组编辑植物。除草剂抗性转化体中靶基因的双等位基因/纯合无转基因突变率在 8% 至 50% 之间。全基因组测序进一步证实了编辑植物中无转基因和无脱靶突变。共编辑策略对于在 T0 代中产生无转基因、基因组编辑植物是有效的，因此是植物遗传改良的有力工具。