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优化的 HDR 介导的 K-荧光蛋白敲入...
图 2：在 K-562 细胞中通过电穿孔优化 HDR 介导的报告基因敲入。A. LMNA -EGFP 供体质粒单独电穿孔，浓度增加，显示非特异性 EGFP 表达量较低。Cas9 蛋白：crRNA：tracrRNA 电穿孔，LMNA -EGFP 供体质粒浓度增加，显示 EGFP 表达相关增加。B. 放大倍数增加后，HDR 介导的敲入样本中 EGFP 表达的定位与 LMNA 的预期一致，位于细胞核中，并与 Hoechst 染色共定位。C. HDR 介导的敲入细胞群的流式细胞术分析显示，随着 DNA 供体质粒数量的增加，EGFP 表达增加高达 32%。单独 DNA 供体质粒对照的相应分析显示所有剂量的 EGFP 表达均低于 0.5%（未显示数据）。
基因
™ ( 合成的crRNA 和tracrRN) 和重组的Cas9 蛋白可以形成特核糖核蛋白复合物(RNP) 。 直接转染sgRNA-Cas9 RNP 可以避免质体DNA 嵌入宿主基因组， 也可进一步增强和扩展CRISPR 基因修饰技术的应用。 早期的报导表明， 与转染Cas9 质体相比， 利用sgRNA-Cas9 RNP 转染的基因组修饰具有更高的特异性(Juris et al. 2015, Kim et al., 2014, Lin et al. 2015, Liang et al. 2015) 。 此外， sgRNA- Cas9 RNP 技术在细胞治疗应用中也具有更好的愿景， 比如近期成功获得基因插入的人类原代T 细胞(Schumann et al. 2015) 。
第 14 章 CRISPR/Cas13：一种用于植物 RNA 编辑的新型新兴工具
摘要 成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）是细菌和古菌中对抗入侵核酸和噬菌体的适应性免疫系统。根据效应蛋白的组成，CRISPR/Cas大致分为多种类型和亚型。其中，VI型CRISPR/Cas系统尤受关注，有VI-A、VI-B、VI-C和VI-D四个亚型，被认为从转座子进化而来。这些亚型在结构架构和机制上表现出差异，具有多种Cas13a（C2c2）、Cas13b1（C2c6）、Cas13b2（C2c6）、Cas13c（C2c7）和Cas13d效应蛋白。CRISPR/Cas13 核糖核酸酶将前 crRNA 加工成成熟的 crRNA，后者在病毒干扰过程中靶向并敲除噬菌体基因组的单链 RNA。这种蛋白质的高特异性 RNA 引导和 RNA 靶向能力使其能够与多种效应分子融合，为 Cas13 介导的 RNA 靶向、追踪和编辑领域开辟了新途径。CRISPR/Cas13 具有靶向包括植物在内的 RNA 的独特功能，因此可以用作一种新的工具，用于工程干扰植物病原体（包括 RNA 病毒），具有更好的特异性，并可用于植物中的其他 RNA 修饰。荧光探针标记的失活可编程 Cas13 蛋白可用作体外 RNA 研究的替代工具。工程化的 Cas13 也可用于可编程的 RNA 编辑。CRISPR/Cas13 的高靶向特异性、低成本和用户友好的操作使其成为多种基于 RNA 的研究和应用的有效工具。因此，本章的重点是 CRISPR/Cas 系统的分类、VI 型 CRISPR/Cas 系统的结构和功能多样性，包括其发现和起源、机制以及 Cas13 在植物 RNA 编辑中的作用。
利用冲击波介导的核糖核蛋白递送对烟草 ADF 基因进行定向诱变，提高渗透胁迫耐受性
建立了工作流程后，我们随后使用脉冲激光诱导冲击波法将 RNP 直接递送到完整的烟草叶片细胞中，这比原生质体或受精卵更容易制备和处理。我们引入了一个预组装的 RNP，它包含 HiFi Cas9 蛋白、crispr RNA (crRNA) 和 ATTO-550 标记的反式激活 crispr RNA (tracrRNA)，靶向烟草 PDS 或 ADF 基因。荧光 tracrRNA 允许直接筛选转染细胞，因此不需要选择标记基因（图 2A'）。样本大小和实验设置与上面描述的 DsRed 转染相同（图 1A、B）。根据我们的观察，ATTO-550 荧光在激光处理后 24 小时开始变得可见，在转染后 48 小时达到最大值。根据制造商的说法，RNP 复合物的活性最长为 72 小时。
CRISPR-Cas 基因组编辑工具：具有潜在阻断作用的癌症治疗窄道
包括各种类型的核酸酶，例如 Cas9、Cas1、Cas3、Cas4 和 Cas12a (8-19)。有趣的是，最近的一项发现报告了一种新型基因编辑酶 CasX，据称它比 Cas9 更有效、更高效 (15)。编码的核酸酶 Cas9 与 trcrRNA 和 crRNA 形成复杂的结构，并寻找与 CRISPR 阵列位点中存在的间隔序列匹配的 DNA 序列。II 型系统被认为是三种 CRISPR 系统中最重要的系统，对基因组编辑技术贡献巨大 (20-22,24-26)。最近，有报道称 CRISPR 系统存在脱靶活性问题。为了消除这些问题，人们试图借助基因组学和生物信息学工具来修改 CRISPR 系统 (8-19)。有趣的是，据报道，使用 CRISPR 编辑工具可以生成可编程的 3D 核组织，从而实现特定的基因表达集 (28)。
基于 CRISPR 的基因组编辑器的药物输送系统
成熟和新兴的基因编辑器 CRISPR–Cas 系统是一种广泛存在的原核生物防御系统，用于防御入侵的噬菌体和外来遗传物质。在自然界中，它们由 (1) 效应模块（在第 1 类 CRISPR 系统中是蛋白质复合物，在第 2 类 CRISPR 系统中是单个效应子）和 (2) 适应模块（将外来序列整合到 CRISPR 阵列中，crRNA 从中表达）组成。由于这些系统是 RNA 引导的，因此可以通过改变 crRNA 的序列重新定位它们，这为可编程基因组编辑工具提供了一个起点，有关此类工具的开发已在其他地方进行了综述 5 – 13 。第一个被设计用于人类细胞的系统是 2 类 CRISPR–Cas9 系统 14、15，其中化脓性链球菌 CRISPR–Cas9 系统 (SpCas9；也简称为 Cas9) 是目前使用最广泛的系统。Cas9 在与向导 RNA（对于 Cas9 来说称为单向导 RNA (sgRNA)）互补的靶位点处产生双链断裂 (DSB)；在人类细胞中，这些 DSB 可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 修复，这一过程通常会导致基因功能丧失。早期临床数据 16 表明，NHEJ 介导的基因敲除会降低致病蛋白的表达（见相关链接）。靶向的 DSB 也可以通过宿主细胞的内源性同源修复机制进行修复，从而整合由 Cas9 和 gRNA 随附的外源提供的模板 DNA。 Cas9 已被改造以实现其他基因组结果。通过突变 SpCas9 的催化残基（参考文献 17），Cas9 可以转化为可编程的 DNA 结合蛋白，通常称为死 Cas9 (dCas9)。尽管单独使用 dCas9 可以通过阻止 RNA 聚合酶的通过来减少靶基因转录，但 dCas9 与转录抑制因子（例如 Krüppel 相关框结构域 18）或表观基因组修饰因子（例如 DNA 甲基化酶 DNMT3A 19、20）的融合已促成 CRISPR 干扰系统的产生。类似地，dCas9 可通过融合转录激活因子（如 VP64（参考文献 21））或表观基因组修饰因子（如人类乙酰转移酶 p300（参考文献 22）或 TET1 脱甲基酶 19、23）用于靶向转录激活。
180071523013.pdf
CRISPR/Cas技术是一种简单、快速且极其有效的基因编辑方法。为了描述该技术的原理和医学应用，在 Pubmed、SciELO、Google Scholar 和 Cochrane Library 中进行了文献综述，描述词为“基因编辑”、“基因组编辑”、“CRISPR-Cas 系统”和“CRISPR 相关蛋白 9”。 CRISPR/Cas9 系统包含 Cas 内切酶和两种 RNA。 Cas将入侵的噬菌体DNA切成片段，作为间隔物整合到CRISPR序列中。然后，CRISPR 序列被转录生成 crRNA 和 tracrRNA，它们形成双螺旋 RNA 结构，招募 Cas 进行切割。该系统通过质粒、RNA或核糖核蛋白引入细胞内部。核定位序列允许 CRISPR/Cas9 进入细胞核。 CRISPR/Cas9技术是一种高效的精准基因编辑工具，对科学研究有着重大影响。
CRISPR 技术：犹太人的法律视角
CRISPR 技术有两个基本生物学组成部分（图 1）。2 第一组组成部分是称为 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 的蛋白质，其功能如同分子剪刀，可启动 DNA 的双链断裂。第二组组成部分是向导 RNA，由两部分组成：CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 CRISPR RNA (tracrRNA)。向导 RNA 会瞄准 DNA 上 Cas 进行断裂的确切位点。CRISPR 介导的编辑机制主要有三种类型，可产生基因操作。首先，CRISPR 可在 DNA 中造成单次切割，破坏原始 DNA 序列并导致基因失活。其次，可以使用两个向导 RNA 删除较大的 DNA 片段。在每个 DNA 位点进行切割后，细胞修复过程会将剩余 DNA 片段的不同末端连接起来。第三，可以将 DNA 模板添加到 CRISPR 机制中，使细胞能够纠正基因，甚至插入新基因。
基因组编辑技术，机制和改善治疗性植物化学物质的产生：机会和前景
图1各种基因组编辑工具。（a）锌指核酸酶（ZFN）充当二聚体。每个单体由DNA结合结构域和核酸酶结构域组成。每个DNA结合结构域由3 - 6个锌指重复序列组成，识别9 - 18个核苷酸。核酸酶结构域由II型限制性核酸内切酶FOK1组成。（b）转录激活剂类似核酸酶（Talens）：这些是类似于ZFN的二聚体酶。每个亚基由DNA结合结构域（高度保守的33 - 34个氨基酸序列）和FOK1核酸酶结构域组成。（c）CRISPR/CAS9：CAS9核酸内切酶由SGRNA（单引导RNA：CRRNA和TRACRRNA）引导，用于靶特定裂解。二十个核苷酸识别位点存在于原始基序（PAM）的上游（来自Arora＆Narula，2017年）。版权所有©2017 Arora和Narula。这是根据Creative Commons归因许可（CC BY）的条款分发的开放访问文章。
基于 CRISPR-Cas9 的基因组工程...
（Doudna 和 Charpentier，2014 年）并在图 1a 中以示意图形式显示。许多细菌物种都有 CRISPR 和 Cas 基因座的变体，其中作为基因组编辑工具研究最广泛的变体是 CRISPR-Cas9 系统（Makarova 等人，2011 年）。CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑需要一个 Cas9 引导 RNA（gRNA）复合物，其中包含 Cas9、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活 CRISPR RNA（tracrRNA）（见框 1：CRISPR 术语）。如前所述，可以通过多种方法将该复合物引入靶细胞（Lino 等人，2018 年；Shi 等人，2021 年）。在 crRNA 的引导下，该复合物与补体 DNA 结合，并伴有侧翼的原始间隔区相邻基序 5 0 -NGG-3 0（对于化脓性链球菌 Cas9）（ Chylinski 等人，2013）。Cas9-gRNA 复合物在靶位点诱导双链断裂（ Deltcheva 等人，2011；Shah 等人，2013），靶细胞可以通过非同源末端连接 (NHEJ)（ Hefferin 和 Tomkinson，2005）或同源定向修复 (HDR)（ Liang 等人，1998）进行修复。在 NHEJ 中，断裂的 DNA 链被重新连接，可以直接重新连接，也可以在随机核苷酸插入或缺失后重新连接（ Takata 等人，1998）。这通常会导致移码突变和过早的终止密码子，因此，这种机制很容易用于敲除目的蛋白的表达。在 HDR 中，双链断裂是使用姐妹染色单体作为同源模板链来修复的。通过多次交换、DNA 合成和连接，受损链可以得到精确修复（Takata 等，1998）。不用姐妹染色单体作为模板链，而是将含有所需突变或基因盒的外源 DNA 模板以单链或双链 DNA 的形式引入，同源臂在外侧（Chen 等，2011；Radecke 等，2010；Rouet 等，1994）。多年来，越来越多的实验皮肤病学领域的研究利用了 CRISPR-Cas9 工具箱，尽管目前的数量有限，但在过去 5 年中有所增加（图 1 b 和 c 以及表 1）。本综述旨在认识到在人类表皮角质形成细胞 (KC) 中进行的所有 CRISPR-Cas9 工作，以确定在不同人类 KC 细胞来源中可用的最佳实践和成功策略的关键决定因素，同时为未来使用 CRISPR-Cas9 进行研究提供关键考虑，无论是基础应用还是临床应用。