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使用 Benchling 教程设计 gRNA：Myriam Sévigny 撰写，2022 年基因组生物学单元由 HiLIFE 和赫尔大学医学院支持
• 对于基因敲除，gRNA 通常靶向 5' 组成性表达的外显子，这降低了由于可变剪接而从 mRNA 中移除目标区域的可能性。 • 根据经验，避免靶向编码蛋白质 N' 末端附近氨基酸的位点，以减轻细胞使用注释起始密码子下游的替代 ATG 的能力。同样，避免靶向编码蛋白质 C' 末端附近氨基酸的位点，以最大限度地增加产生无功能等位基因的机会。对于 1 千碱基基因，由于潜在靶向位点每 8 个核苷酸中出现约 1 个，将 gRNA 限制在蛋白质编码区域的 5 – 65% 仍将导致有数十种 gRNA 可供选择。有这么多可能性，选择具有优化序列的 gRNA 是首要任务。 • 如果可能，设计 gRNA 以靶向编码已知必需蛋白质结构域的外显子。这种方法的好处是，即使非移码等位基因在重要的蛋白质结构域中出现时也可能改变蛋白质的功能。
tgCRISPRi：使用截短的 gRNA 和催化活性 Cas9 进行有效的基因敲除
CRISPR 干扰 (CRISPRi) 是一种在哺乳动物细胞中沉默基因的高效方法，它采用酶失活形式的 Cas9 (dCas9) 与一个或多个与靶基因转录起始位点互补 20 个核苷酸 (nt) 的向导 RNA (gRNA) 复合。此类 gRNA/dCas9 复合物与 DNA 结合，阻碍目标基因座的转录。在这里，我们提出了一种替代的基因抑制策略，即使用活性 Cas9 与截短的 gRNA (tgRNA) 复合。Cas9/tgRNA 复合物与特定靶位点结合而不会触发 DNA 切割。当靶向转录起始位点附近时，这些短的 14-15 nts tgRNA 可有效抑制果蝇体细胞组织中几种靶基因的表达，而不会产生任何可检测到的靶位点突变。 tgRNA 在与 Cas9-VPR 融合蛋白复合时还可以激活靶基因表达或调节增强子活性，并且可以整合到基因驱动中，其中传统 gRNA 维持驱动，而 tgRNA 抑制靶基因表达。
游离和 gRNA 结合的 FnCas9 和 SpCas9 蛋白的比较结构和动力学研究
基于 CRISPR/Cas9 的基因编辑的引入大大加速了治疗性基因组编辑。然而，CRISPR/Cas9 蛋白的脱靶 DNA 切割阻碍了其临床转化，从而阻碍了其作为可编程基因组编辑工具的广泛使用。尽管已经开发出具有更好错配识别能力的 Cas9 变体，但它们的靶向 DNA 切割率明显较低。在这里，我们将来自新凶手弗朗西斯菌 (FnCas9) 的更特异性的天然 Cas9 与最广泛使用的 SpCas9 蛋白的动力学进行了比较。对两种 Cas9 蛋白的游离形式和 gRNA 结合形式进行了长期原子 MD 模拟，并比较了它们的域重排和与 gRNA 的结合亲和力，以揭示 FnCas9 蛋白特异性增强的可能原因。与 SpCas9 相比，FnCas9 与 gRNA 的结合亲和力更大、域静电更大、波动性更大，这可以解释其特异性增强和对错配的容忍度更低。
IDT 使用 Alt-R CRISPR-Cas9 系统和 Megamer ssDNA 片段进行同源定向修复 (RUO21-0293_003 03/24)
* 我们保证针对人类、小鼠、大鼠、斑马鱼或线虫基因的预设计 gRNA 的性能。对于其他物种，您可以使用我们的专有算法来设计定制 gRNA。如果您有自己的或来自出版物的 gRNA 原型间隔物设计，请使用我们的设计检查工具评估它们的靶向和脱靶潜力，然后再订购使用我们的 Alt-R gRNA 修饰合成的 gRNA。有关预设计 gRNA 保证的详细信息，请参阅 www.idtdna.com/CRISPR-Cas9。
crispr-cas9：革命性的基因组编辑及其...
Roshan Kumar和Ashima Mehta Dronacharya工程学院，印度古尔冈摘要：CRISPR-CAS9技术已成为一种用于精确基因组编辑的革命性工具，为各种生物体的基因操纵提供了前所未有的机会。本文提供了CRISPR-CAS9的全面概述，其中包括其分子机制，应用，挑战和道德考虑。我们讨论了CRISPR-CAS9的基本原理，包括指导RNA（GRNA）在将Cas9核酸酶引导到目标DNA序列中的作用，导致双链断裂和随后的基因组修饰关键词：CRISPR-CAS9，GRNA，GRNA，GRNA，GRNA，GRNA，GRNA，基因组编辑，基因编辑，基本辅助，Protospacer Aidfif（PAMENTIFF/diveme
一个用于体外心脏电生理学的可访问平台
图1。点击编辑的概述和开发。a，单击编辑器的示意图（CE），它是由RNA程序编程的DNA nickase，DNA依赖性DNA聚合酶和ssDNA绑扎域组成的融合蛋白（例如，嗯，核酸内切酶； Huhe）与导向RNA（GRNA）配对。Click-DNA（clkDNA）模板是一种单链DNA寡核苷酸，它编码底漆结合位点（PBS），聚合酶模板（PT）和Huhe识别位点B，从709序列产生的系统生成树47序列47，描绘了Huains多样性的小型元素，该序列是47个序列。量表表示序列之间的分数相关性。c，与ssDNA分子共价磷酸酪氨酸加合物形成共价磷酸酪氨酸加合物的示意图，其中huhe结合了识别顺序以引发单点样共轭反应。d，逐步点击编辑机制，涉及：（1）DNA目标位点释放非目标链（NTS）3'基因组瓣，（2）NTS laps plap杂交与clkDNA PBS，（3）NTS-NTS-NTS-NTS-PBS连接与DNA依赖性DNA Polimentsion（4）nts-pbs intthers（3） clkDNA的编码PT，（5）新合成的3'和天然基因组5'襟翼之间的平衡，以及（6）5'-flap裂解，导致编辑结合。e，在HEK 293T细胞中的点击编辑转染的示意图，涉及CE质粒的共转染（Porcine Circovirus 2（PCV2）Huhe Huhe与NSPCAS9（H840A）融合，并从e.coli dna Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA Polymerase I（DNA））中， clkDNA和一个（或两个）GRNA质粒（S）。ngrna）针对非编辑链的目标编辑效率。f，g，使用DNMT1 GRNA和带有PBS13-PT12的clkDNA插入或读取突变（Indels）的 f，g， f，g， f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g， f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。 CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即f，g，使用PBS13-PT12编码A +3- 5 cag deletion（使用A +49 nick; Panel f）或rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 grna a +rnf2 gkdna A +3-5 clkDNA A +49-PT12替换（带有+5“ 2b”刻度；面板G）。CE1，CE（PCV2-NSPCAS9（H840A）-ECKLENOW），带有一个GRNA，以指导非目标链刻度； CE1.N2，CE1带有额外的grna来指导刻痕（即
GO-CRISP 克隆协议
使用下面的引物模板（表 1），片段 2 可以通过 PCR 扩增（图 4A）。我们建议使用 gRNA NIA TLS1/2 作为 PCR 模板。“NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN”（表 1）代表应由 gRNA 靶序列替换的核苷酸。用于创建 NIA1 靶向片段 2 的引物列于下方作为示例（表 1）——这些引物用于创建 gRNA NIA TLS1/2。引物还在片段末端添加了 BsaI 切割位点（图 4A），这些位点与 gRNA 片段 1 TLS1/2 中的双 BsaI 位点兼容。
加速 CRISPR-Cas 优化
CRISPR-Cas 基因编辑的成功在很大程度上依赖于 gRNA 设计的效率和 gRNA-Cas 复合物与目标 DNA 序列的结合亲和力。我们的一位客户在为其应用选择最佳 gRNA 设计时面临挑战。初始 gRNA 候选物是使用计算机工具设计的，尽管被设计为针对相同的基因组区域，但表现出不一致的结合和编辑效率。为了解决这个问题，我们使用了 CRISPR Analytics 平台的 DNA 结合检测来评估与 Cas9 复合的几种 gRNA 候选物与目标 DNA 扩增子的结合亲和力。该检测包括阳性对照 gRNA 和混乱的阴性对照以供比较。结果显示，gRNA 候选物之间的目标 DNA 结合亲和力存在显著差异，其中两种 gRNA（5 和 6）表现出优于其他 gRNA 的结合（图 1）。
CRISPR/ CAS系统和目标基因组编辑 div>
GRNA与REC叶的结合会引起一系列构象变化，从而产生完全活化的蛋白质。 当Cas9和GRNA的络合物连接时，靶DNA可以连接。 PI结构域识别PAM区域，然后将GRNA种子序列配对。 nuc-lobe的HNH和RuVC域负责靶DsDNA的裂解。GRNA与REC叶的结合会引起一系列构象变化，从而产生完全活化的蛋白质。当Cas9和GRNA的络合物连接时，靶DNA可以连接。PI结构域识别PAM区域，然后将GRNA种子序列配对。nuc-lobe的HNH和RuVC域负责靶DsDNA的裂解。