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使用长读测序对扩增的亨廷顿基因进行单倍型 SNP 等位基因特异性基因编辑
亨廷顿舞蹈症 (HD) 是一种常染色体显性神经退行性疾病，由亨廷顿蛋白 ( HTT ) 外显子 1 的 CAG 三核苷酸重复扩增引起。目前，HD 尚无治愈方法，HD 患者的临床治疗侧重于症状管理。之前，我们展示了使用 CRISPR-Cas9 通过靶向附近 ( < 10 kb) 的 SNP（在外显子 1 附近产生或消除原间隔区相邻基序 (PAM)）来特异性删除扩增的 HTT 等位基因 ( mHTT )。在这里，我们使用 Oxford Nanopore 平台上的多重靶向长读测序方法，全面分析了 983 名 HD 个体中 HTT 外显子 1 两侧 10.4 kb 基因组区域内的所有潜在 PAM 位点。我们开发了计算工具（NanoBinner 和 NanoRepeat）来对数据进行解复用、检测重复并对扩增或野生型 HTT 等位基因上的读数进行分阶段。通过此分析，我们发现 30% 具有欧洲血统的 HD 患者共有一个 SNP，这被证实是人类 HD 细胞系中 mHTT 等位基因特异性删除的有力候选者。此外，多达 57% 的 HD 患者可能通过组合 SNP 靶向成为等位基因特异性编辑的候选者。总之，我们提供了受 HD 影响的个体中 HTT 外显子 1 周围区域的单倍型图。我们的工作流程可应用于其他重复扩增疾病，以促进用于等位基因特异性基因编辑的指导 RNA 的设计。
文章利用 CRISPR-Cas9 技术生成亨廷顿氏病的新同源模型
摘要：亨廷顿氏病 (HD) 是一种致命的神经退行性疾病，由亨廷顿基因 (HTT) 外显子 1 的 CAG 重复扩增引起。尽管亨廷顿氏病具有单基因特性，但其发病机制仍未完全了解，目前尚无有效的治疗方法。基因组工程等新技术的发展为疾病建模领域带来了新机遇，并使得具有相同遗传背景的同源模型的生成成为可能。这些模型对于研究疾病的发病机制和药物筛选非常有价值。本文报告了一系列在 HTT 基因座上具有不同 CAG 重复数的纯合 HEK 293T 细胞系的生成，并展示了它们在测试治疗试剂方面的实用性。此外，利用 CRISPR-Cas9 系统，我们纠正了 HD 人类诱导多能干细胞中的突变并生成了 HTT 基因的敲除，从而为 HD 研究提供了一套全面的同源细胞系。
约翰霍普金斯基因组学 DNA 诊断实验室
亨廷顿病 (HD) 是一种渐进性、致命性、遗传性神经退行性疾病，通常在成人时期发病。亨廷顿病是由 HTT 基因第一个编码区 CAG 重复扩增引起的，这会导致大脑中亨廷顿蛋白异常积聚。人们认为，亨廷顿病的症状是由亨廷顿蛋白沉积物的渐进性积聚引起的。亨廷顿病以常染色体显性模式遗传，这意味着两个 HTT 等位基因中只需有一个扩增即可发病。患有亨廷顿病的父母有 50% 的机会将扩增的 CAG 区域遗传给他们的每个孩子。通过 PCR 和片段大小测定进行的亨廷顿病检测会分析 HTT 基因的 CAG 重复区域以测量重复次数。重复次数可以判断一个人是否有患亨廷顿病的风险。了解一个人的重复次数可以洞察这个人未来的情况、其他家庭成员是否可能有患病风险以及这个人可能生育的孩子的风险。
亨廷顿氏病影响线粒体网络动力学，易受致病性线粒体DNA突变
亨廷顿氏病（HD）主要影响大脑，导致混合运动障碍，认知能力下降和行为异常。它还引起涉及骨骼肌的外周表型。线粒体DYS功能已在HD模型的组织中报道，包括骨骼肌，以及来自HD患者的淋巴细胞和成纤维细胞浮雕。突变的亨廷顿蛋白（Muthtt）表达会损害线粒体质量控制并加速线粒体衰老。在这里，我们获得了新鲜的人类骨骼肌，这是一种有线后组织，自出生以来，在生理水平上表达突变的HTT等位基因，以及HTT CAG重复膨胀突变携带者的原代细胞系，并匹配健康的志愿者，以检查人类HD中是否存在这种线粒体表型。使用超深线粒体DNA（mtDNA）测序，我们显示了影响氧化性PHOS磷酸化的mtDNA突变的积累。组织蛋白质组学表明MTDNA维持的障碍，线粒体生物发生的增加，氧化磷酸化效率较低（较低的复合物I和IV活性）。在全长muthtt中表明了原代人细胞系，裂变诱导的线粒体应激导致正常的线粒体。相比之下，高水平的N末端Muthtt片段的Ex压缩促进了线粒体裂变，导致线粒体裂变较慢，动态线粒体较低。由于体细胞核HTT CAG不稳定性引起的高水平Muthtt片段的表达会影响线粒体网络动力学和线粒体，从而导致致病性mtDNA突变。我们表明，突变体HTT的终生表达引起的线粒体表型，指示新鲜的有丝分裂后人类骨骼肌的mtDNA不稳定性。因此，基因组不稳定性可能不限于核DNA，在核DNA中，它会导致在诸如纹状体神经元之类的特别脆弱细胞中HTT CAG重复长度的体细胞扩张。除了针对因果突变的努力外，促进线粒体健康可能是治疗HD等DNA不稳定性疾病的互补性层次。
亨廷顿氏病影响线粒体网络动力学，易受致病性线粒体DNA突变
亨廷顿氏病（HD）主要影响大脑，导致混合运动障碍，认知能力下降和行为异常。它还引起涉及骨骼肌的外周表型。线粒体DYS功能已在HD模型的组织中报道，包括骨骼肌，以及来自HD患者的淋巴细胞和成纤维细胞浮雕。突变的亨廷顿蛋白（Muthtt）表达会损害线粒体质量控制并加速线粒体衰老。在这里，我们获得了新鲜的人类骨骼肌，这是一种有线后组织，自出生以来，在生理水平上表达突变的HTT等位基因，以及HTT CAG重复膨胀突变携带者的原代细胞系，并匹配健康的志愿者，以检查人类HD中是否存在这种线粒体表型。使用超深线粒体DNA（mtDNA）测序，我们显示了影响氧化性PHOS磷酸化的mtDNA突变的积累。组织蛋白质组学表明MTDNA维持的障碍，线粒体生物发生的增加，氧化磷酸化效率较低（较低的复合物I和IV活性）。在全长muthtt中表明了原代人细胞系，裂变诱导的线粒体应激导致正常的线粒体。相比之下，高水平的N末端Muthtt片段的Ex压缩促进了线粒体裂变，导致线粒体裂变较慢，动态线粒体较低。由于体细胞核HTT CAG不稳定性引起的高水平Muthtt片段的表达会影响线粒体网络动力学和线粒体，从而导致致病性mtDNA突变。我们表明，突变体HTT的终生表达引起的线粒体表型，指示新鲜的有丝分裂后人类骨骼肌的mtDNA不稳定性。因此，基因组不稳定性可能不限于核DNA，在核DNA中，它会导致在诸如纹状体神经元之类的特别脆弱细胞中HTT CAG重复长度的体细胞扩张。除了针对因果突变的努力外，促进线粒体健康可能是治疗HD等DNA不稳定性疾病的互补性层次。
Life Edit Therapeutics 推出 LETI-101 等位基因选择性基因编辑，用于治疗亨廷顿氏病
• 患者等位基因必须仅与 mut 等位基因中的 T 杂合 • CAG 重复扩增必须与目标等位基因同相 • 结果是选择性编辑 mHTT，从而降低 mHTT 蛋白质产量，同时保留 WT HTT 蛋白质产量
罕见疾病
Sci USA ）对罕见病的分析显示，期刊文章中关注度最高的是亨廷顿舞蹈症、15,16 重症肌无力、17 ALS、18–20 罕见肿瘤和癌症、21–27 和系统性红斑狼疮 (SLE)。28–30 人们对罕见病的持续科学兴趣意味着研究可以产生高影响力的出版物，例如英国研究人员于 2019 年在新英格兰医学杂志上发表的“针对亨廷顿舞蹈症患者的亨廷顿蛋白表达”31。该文章描述了 Ionis Pharmaceuticals 和 F. Hoffmann–La Roche 设计的寡核苷酸的 I/IIa 期试验结果，该寡核苷酸用于抑制 HTT 的信使核糖核酸 (mRNA)，HTT 是导致亨廷顿舞蹈症的主要基因，此后已被引用超过 400 次。
CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑可延长亨廷顿氏病小鼠模型的寿命并改善运动障碍
亨廷顿舞蹈症 (HD) 是一种目前无法治愈的致命神经退行性疾病，由亨廷顿 (HTT) 基因外显子 1 内的 CAG 三核苷酸重复扩增引起，从而产生一种突变蛋白，这种突变蛋白形成内含物并选择性破坏纹状体和其他相邻结构中的神经元。来自 CRISPR-Cas9 系统的 RNA 引导的 Cas9 内切酶是一种诱导 DNA 双链断裂的多功能技术，可刺激引入移码诱导突变并永久性地禁用突变基因功能。在这里，我们展示了来自金黄色葡萄球菌的 Cas9 核酸酶，一种小的 Cas9 直系同源物，可以与单个引导 RNA 一起包装到单个腺相关病毒 (AAV) 载体中，可用于在体内递送至纹状体后破坏 R6/2 小鼠 HD 模型中突变 HTT 基因的表达。具体来说，我们发现 CRISPR-Cas9 介导的突变 HTT 基因破坏导致神经元内含物减少 50%，并显著延长寿命和改善某些运动障碍。因此，这些结果说明了 CRISPR-Cas9 技术通过体内基因组编辑治疗亨廷顿氏病和其他由三核苷酸重复扩增引起的常染色体显性神经退行性疾病的潜力。
长的体细胞DNA重复扩张驱动亨廷顿疾病的神经退行性
亨廷顿疾病（HD）是一种致命的遗传疾病，其中大多数纹状体投射神经元（SPN）退化。有关HD发病机理的中心生物学问题是亨廷顿蛋白（HTT）基因中引起疾病的DNA重复膨胀（CAG N）如何导致数十年的明显潜伏期后神经变性。遗传的HTT等位基因具有更长的CAG重复急性疾病发作；这种重复的长度也随时间变化，产生了体细胞镶嵌性，调节DNA重复稳定性的基因可能会影响高清年龄。了解细胞的CAG重复长度与其生物学状态之间的关系，我们开发了一种单细胞方法，用于测量CAG重复长度以及全基因组RNA的表达。我们发现，HTT CAG重复在HD-vulnerable SPN中从40-45个CAG扩展到100-500+ CAG，而在其他纹状体细胞类型中则不扩展，而这些长的DNA重复扩展在不同时间通过单个SPN获得。令人惊讶的是，从40个CAGS的体细胞膨胀对基因表达没有明显的影响 - 但是具有150-500+ CAGS的神经元具有深刻的基因表达变化。这些表达的变化涉及数百个基因，并在进一步的CAG重复扩张旁边升级，侵蚀了阳性，然后神经元同一性的负面特征，并在衰老/凋亡基因的表达中达到顶峰。跨高清阶段的纹状体神经元丧失率反映了神经元进入该生物学变形状态的速率。我们得出的结论是，在HD过程中的任何时候，大多数神经元具有无害的（但不稳定的）亨廷顿基因，而HD发病机理几乎是神经元生命的DNA过程。我们的结果表明，纹状体神经元中的HTT CAG重复进行数十年的生物学安静膨胀，因此，由于它们异步越过高阈值，因此SPN会使SPN迅速和异步变性。
临床前磁共振成像和光谱对亨廷顿氏病的贡献
亨廷顿氏病是一种遗传性疾病，其特征是由于纹状体中中刺神经元的变性而导致精神病，认知和运动症状。前阶段先于发作，持续数十年。当前的生物标志物包括使用磁共振成像（MRI）的临床评分和纹状体萎缩。这些标记对前阶段中细微的细胞变化缺乏敏感性。MRI和MR光谱法提供了不同的对比度，用于评估疾病中的代谢，微结构，功能或血管改变。它们已用于患者和小鼠模型。小鼠模型研究退化过程的特定机制可能引起人们的兴趣，可以更好地理解从前驱阶段到有症状阶段的发病机理，并评估治疗功效。小鼠模型可以分为三种不同的构造：表达人类亨廷汀（HTT）外显子1的转基因小鼠，具有表达全长人类HTT的人造染色体的小鼠，以及插入鼠类HTT基因中的CAG膨胀的敲入小鼠模型。几项研究已使用MRI/S来表征这些模型。但是，可用的多种方式和鼠标模型使人们对这种富裕的语料库的理解变得复杂。本综述旨在概述使用MRI/S为每个HD的MRI/S获得的结果，以提供使用HD小鼠模型的神经影像学研究概念的有用资源。本综述还旨在涵盖这一方面，以证明MRI/S对于研究高清的重要性。最后，尽管在将临床前方案转换为临床应用方面遇到困难，但在临床前模型中鉴定出的许多生物标志物已经在患者中进行了评估。