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I.简介使用Smart®技术简介SMRNA-SEQ智能Smrna-Seq套件for Illumina(Cat。nos。635029,635030,635031)旨在生成高质量的SMRNA-SEQ库,用于在Illumina平台上进行排序。该套件的开发可直接与总RNA或富集的小RNA输入(范围为1 ng – 2 µg)。通过合并包括Takara Bio的专有智能(巫婆机构和R na T Emplate的5端)技术和锁定的核酸(LNA)的功能,该试剂盒使用户可以分析各种SMRNA物种,并生成相当复杂的库,从少于1 ng的Input材料中产生相当大的复杂性。Illumina适配器和索引序列在文库放大过程中以无连接方式掺入(图1),以确保不同的SmRNA物种以最小的偏见表示。
用途:EPINEXT™DNA库制备试剂盒(Illumina)适合使用Illumina Sequencer制备下一代测序应用的DNA库,其中包括基因组DNA-SEQ,chip-seq,chip-seq,medip/hmedip-seq,bisulfite-seq,bisulfite-seq,bisulfite-seq,targeted reparted reqe reqecencess。该套件的优化协议和组件允许使用偏置减少的偏差快速构建非标语(单个复合)和条形码(多重)DNA库。起始材料和输入量:起始材料可以包括从各种组织或细胞样品中分离出的碎片dsDNA,从芯片反应,MEDIP/HMEDIP反应或外显子捕获中富集的dsDNA。DNA应该相对不含RNA,因为大的RNA部分会损害末端修复和DA尾巴,从而降低了连接能力。DNA的输入量可以从5 ng到1 ug。为了获得最佳准备,输入量应为100 ng至200 ng。对于无扩增,需要500 ng或更多。预防措施:避免交叉污染,将样品或溶液仔细移液管中。使用气溶胶式移液器尖端,并始终在液体转移之间更改移液器。在整个过程中戴上手套。如果手套与样品之间接触,请立即更换手套。
尽管基于NGS的全基因组测序(WGS)为微生物学实验室提供了速度,准确性和信息深度的显着优势,但DNA提取和库制备步骤仍然是NGS工作流程中的显着瓶颈。NGS文库进行宏基因组研究的准备通常始于耗时和劳动密集型基因组DNA提取步骤。为了应对宏基因组学中的这一挑战,Illumina提供Illumina DNA准备和Illumina粗裂解物方案。此方法直接从原油裂解物中支持快速简便的库准备。直接从粗裂解物中进行测序消除了与DNA提取步骤相关的时间和成本。除了提高速度和效率外,Illumina DNA Prep还为样品输入类型和细胞裂解方法(包括直接细菌菌落,血液和唾液)提供了出色的灵活性。
RNA 样本要求:RNA 样本应不含盐(例如 Mg 2+ 或胍盐、二价阳离子螯合剂(例如 EDTA 或 EGTA)或有机物(例如苯酚或乙醇)。RNA 必须不含 DNA。gDNA 是 RNA 制备中的常见污染物。它可能来自有机提取的中间相,或者当固相 RNA 纯化方法的二氧化硅基质超载时。如果总 RNA 样本可能含有 gDNA 污染,则用 DNase I 处理样本以去除所有痕迹的 DNA(此试剂盒中不提供 DNase)。用 DNase I 处理后,应从样本中去除酶。DNase I 的任何残留活性都可能降解富集所需的寡核苷酸。可以使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀从提取物中去除 DNase I。
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还建议在用户指南中查看“ PipSeq Dry Bath操作”指令,以了解如何在不同的干浴协议之间进行更改以及如何为每个程序手动设置盖子模式(请参阅用户指南第3.2.3节)。选择程序时不会自动设置盖模式。您必须选择正确的程序,然后选择“编辑”,然后使用编辑屏幕底部的“ Lidmode”按钮,以切换到正确的盖子模式设置。“ +5.0”设置用于细胞裂解(程序A),“ 105”设置用于核裂解(程序B)和cDNA合成(程序C)。选择“保存/返回”以返回操作屏幕。另外,请确保将正确的管块安装在干浴中以用于使用的套件(T2/T10的0.5 ml管块,T20的1.5 ml管块,T100的5 ml管块)。
Illumina单细胞3'RNA Prep的简单基于涡旋的方法提供了具有成本效益的可扩展性。对于更大的单元格数,请使用较大的体积PIP管。1从数百到数十万个细胞的广泛处理范围从飞行员和低细胞多样性项目到复杂的组织分析,都支持研究应用需求。1当前的套件配置每个样品最多可介绍2000个单元(T2试剂盒),每个样品10,000个单元(T10试剂盒),每个样品20,000个单元格(T20套件)或每个样品100,000个单元格(T100套件)。测定能力增加细胞吞吐量可以更好地揭示稀有细胞类型(图5)。使用96个唯一双重索引,示例多路复用允许用户并行运行许多样本(表2)。(a)冷冻保存的人外周血单核细胞(PBMC)的均匀歧管近似和投影(UMAP),检测到的31,613个细胞和79%的捕获速率,使用Illumina单细胞3ʹRNA RNA PREP T20 KIT。(b)从冷冻组织中的小鼠脑核的UMAP,检测到155,000个核和78%的捕获率,使用Illumina单细胞3ʹRNA Prep T100 kit。
1。DNA碎片(根据套件的目录选择)PCR Enrichment ....................................................................................................... 9 3.Size Fractionation and Purification of Amplication Product .............................. 10 4.Library Quality Control ......................................................................................... 11 Library Structure ................................................................................................................... 12 Sequencing Related ............................................................................................................... 12 Note ........................................................................................................................................ 14 Appendix ........................................................................................................................................ 14
有针对性的测序可以对基因组感兴趣的特定领域进行集中时间,成本和数据分析,并启用具有更高覆盖率的测序。靶向测序涉及基因组中基因片段或基因面板的富集。通过聚合酶链反应(PCR)特别快速,成本效率地进行靶向测序所需的富集。尤其是Amplicon测序是一种负担得起,健壮且成熟的NGS方法,可在广泛的应用领域(包括肿瘤学,进化生物学和微生物组研究)中提供高吞吐量。在所有NGS应用中,DNA测序库的质量对制备步骤以及最终结果都有重大影响。[2]因此,以最高的精度和可重复性进行DNA文库制备很重要。DNA库的扩增子测序准备涉及一系列具有酶促孵育的步骤,适配器连接,