此SOP描述了通过高通量多重PCR捕获围绕单核苷酸多态性(SNP)的区域的实验室程序,用于Illumina Miseq测序。这称为测序(GB)称为基因分型。它涵盖了内部验证的重新平衡底漆面板的使用,这有助于在所有目标基因座上放大。在PCR本身内实现了库收益率的实质性归一化,从而消除了对DNA输入或库后量化和自定义合并的预先归一化的任何要求。Amplicons included in the two-step PCR protocol described within this SOP are designed to capture a narrow size range (190-250bp inclusive of priming sites) to complement the sequencing length of the MiSeq v2 300 kit (Illumina, San Diego, CA), whilst enabling efficient Ampure XP beads size selection away from contaminating smaller off-target amplification products.根据GBS测试和重新平衡SOP重新平衡引物(请参阅GBS02_TESTING_AND_BALICCANCY)。这最大化了多路复用中所有扩增子的覆盖范围的均匀性。有关此过程的更多信息,请参见附录1。
Dovetail®,DovetailGenomics®和Hirise®是美国和/或其他国家的Cantata Bio LLC的全资子公司Dovetail Genomics,LLC的商标。iLlumina®,HISEQ®,Miseq®,Miniseq®,ISEQ®,NextSeq®,NovaseQ®是Illumina,Inc。的注册商标。BeckmanCoulter™和Spriselect®是Beckman Coulter,Inc.Qubit®的商标或注册商标。Tapestation®和Bioanalyzer®系统是安捷伦技术的注册商标。Invitrogen®是Thermo Fisher Scientific Inc.的注册商标
将在预定的家庭中进行,粪便样品将在招募后六个月内随机收集两次。总基因组DNA将从样品中分离出来。底漆集将使用实时PCR进行放大,然后将在Illumina Miseq平台中测序扩增子。统计和生物信息学分析将在RSTUDIO软件和Qiime2中进行。
Illumina在Imlumina平台上测序在Illumina平台上测序的cleanplex amplicon库工作流程设置建议建议使用Illumina的本地运行经理(LRM)DNA Amplicon分析模块进行分析。LRM DNA扩增子分析模块v2.1.0可在ISEQ(控制软件V1或V2),Miseq(MCS V3),NextSeq 500/550(NCS 4.0)和NextSeq 500DX(NCS 4.0)上获得。LRM DNA扩增子分析模块v3.0.0.14可在Miseq(MCS v4.0)上获得。这些说明是一个简单的摘要,描绘了如何为已经完成的运行设置分析,或设置新运行以包括分析。样品必须通过基因组进行分析以进行分析:如果在一个测序运行中存在不同的基因组,则只能设置新运行以用一个基因组进行运行分析。但是,这些样品可以在同一运行中进行测序,然后通过基因组分批分析。如果测序运行中的所有样本均来自同一基因组,则用户可以使用任何一种分析方法。此模块对齐扩增子读取针对清单文件中指定的参考,并要求变体针对目标区域。工作流程还产生了运行质量和覆盖信息的摘要报告。有用的提示和资源:●有关其他详细信息和故障排除,请参阅Illumina的最新本地运行经理DNA
证明是在Poka-Yoke中:客户反馈在Miseq I100系列中工作的每个设计团队的潜在客户都为最终产品感到自豪,尤其是当他们听到其第一批客户的轶事有关他们喜欢的新功能时。“回头看研究并说,‘是的,我们将其确定为差异化的战略领域,” Settipani说。“这是一个很好的例子,说明,如果您尽早参与客户,您有时间嵌入这些想法,测试它们,并确保我们正在开发一种将受到好评的产品。”
© 2013-2014 Illumina, Inc. 保留所有权利。Illumina、IlluminaDx、BaseSpace、BeadArray、BeadXpress、cBot、CSPro、DASL、DesignStudio、Eco、GAIIx、Genetic Energy、Genome Analyzer、GenomeStudio、GoldenGate、HiScan、HiSeq、Infinium、iSelect、MiSeq、Nextera、NuPCR、SeqMonitor、Solexa、TruSeq、TruSight、VeraCode、南瓜橙色和 Genetic Energy 流动碱基设计是 Illumina, Inc. 的商标或注册商标。本文中提到的所有其他品牌和名称均为其各自所有者的财产。出版号 770-2012-059 截至 2014 年 11 月 19 日有效
补充材料。材料与方法文库制备和 Miseq (Illumina®) 测序使用文库制备指南 (LPG) ( https://support.illumina.com/downloads/16s_metagenomic_sequencing_library_preparation.html ) 中报告的 Illumina 接头序列和引物悬垂部分(正向和反向)扩增 16S rRNA 基因的 460 bp V3-V4 高变区。使用以下 PCR 反应扩增每个 DNA 样本:2.5 µl 5 ng/ µl DNA、5 µl 引物正向悬垂部分、5 µl 引物反向悬垂部分、12.5 µl 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems)。使用 LPG 中报告的循环程序。 PCR 产物在 2% 琼脂糖凝胶(GellyPhor LE,Euroclone SPA,意大利米兰)上电泳分离,并用 GelRed™ 核酸凝胶染料(Biotium,美国加利福尼亚州海沃德)染色。通过紫外光透射仪观察预期长度的 PCR 产物的存在。然后,用 NucleoMag 试剂盒纯化 DNA 扩增子以清理和选择 NGS 文库制备反应的大小(Macherey-Nagel),并按照制造商的说明使用 Illumina® DNA/RNA UD Indexes Tagmentation 试剂盒对每个样本进行索引。在验证和定量之前,对文库进行进一步纯化。在 Agilent 4150 TapeStation D1000 ScreenTape 检测仪(安捷伦科技公司)上对文库进行验证,以验证大小,而定量则使用 Qubit 4 荧光计(赛默飞世尔科技,美国)。根据 DNA 扩增子的大小,应用 Illumina LPG 中报告的公式,以 nM 为单位计算最终的 DNA 浓度。最后,将每个文库中的 5 µl 稀释 DNA 等分试样混合,以合并具有唯一索引的文库。在 Miseq 加载之前,根据 Illumina LPG 说明对合并的文库进行变性和稀释。使用 MiSeq Reagent Micro Kit v2(500 个循环)加载合并的文库,运行包括 20% PhiX 作为内部对照。生物信息学分析测序数据包含在包含带有原始读取的 FASTQ 文件的文件夹中(R1 文件包含每个样本的正向读取,R2 文件包含每个样本的反向读取),使用 FastQC(英国剑桥 Babraham Institute)进行质量检查。然后,使用 DADA2 R 包(Callahan 等人,2016 年)处理 R1 和 R2 文件以生成扩增子序列变体 (ASV)(图 1)。最终生成了 ASV 表,总结了每个样本的不同 ASV 的数量。
生物修复是最经济,最环保的,广泛使用的土壤回收技术之一,如果污染原油和石油产品4)。这项技术基于由两个或多个菌株组成的微生物关联,因为将碳氢化合物氧化微生物的单一文化引入到石油污染的环境中无法完全解决纯化问题。许多科学论文已专门研究该问题5,6)。独特的细菌群落适合于石油污染的土壤中发生的污染。在Aitkeldiyeva等人的工作中。7),使用Illumina Miseq序列,在哈萨克斯坦沉积物的油污染土壤样品中微生物群落的细菌结构和多样性
囊性纤维化(CF)患者的肺肺部容易受到铜绿假单胞菌的感染(1)。cf肺通常由形成生物膜的非粘液铜绿假单胞菌菌株定植,并且在粘液菌株过量产生藻酸盐的出现后发生慢性感染(2)。他们的生物膜对抗生素和IMUNE介质具有高度抗性,并导致肺部下降(2,3)。铜绿假单胞菌菌株是从慢性感染的成年CF患者的痰液样本中分离出来的,并在法国南特的中心医院大学中心。由于这些痰样品仅用于分离细菌,但不用于人类细胞或人类DNA,因此法国法律(2016-1537,2016年11月16日)不要求由机构伦理委员会审查和批准该研究或参与者提供书面或言语知情的同意。细菌,并使用基质辅助激光解吸离子 - 流量质量光谱法(MALDI-TOF MS [VITEK; VITEK; BIOMERIERIEUX; BIOMERIERIEUX,MARCY-LECELANCE,france)鉴定为铜绿假单胞菌。使用了每个患者的单个分离株。主要基于它们的生物膜结构和粘液表型,分离株MUC-N1,MUC-N2,MUC-P4和MUC-P5被选择构成用于测试抗体FILM化合物的应变板(M. Simon,E.Pernet,E.Pernet,E.Pernet,E.Jouault,A.Jouault,E.Portier,E.M.Boukigb,S.Boukig,S。Pinaud,C。 POC-Duclairoir,M。G。J. Feuilloley,O。Lesouhaitier,J。Caillon,S。Chevalier,A。Bazire和A. Dufour,提交出版),促使我们对其基因组进行了测序。在37°C下在液体LB培养基中生长在LB琼脂板中挑选的单个菌落接种的液体LB培养基中生长,并使用基因组基因组DNA纯化试剂盒(Fisher Fisher Scientifip,France,France)使用基因组基因组DNA纯化的基因组DNA,并使用手机的推荐并评估了双重态度(There the)。量子液计(Thermo Fisher Scientifim,美国)和1%琼脂糖凝胶电泳。 使用Illumina Nextera XT DNA库准备套件制备了测序库,按照制造商的协议。 在Miseq仪器(LMSM基因组平台,Rouen Normandy University,Evreux,France,France,France)上进行了测序,并使用Miseq Reagent Kit Kit Kit v.3(2 250 BP)进行了双指数配对末端读数。 默认参数用于所有软件,除非另有说明。 使用Trimmomatic V.0.36(4)对读数进行修剪,并使用Multiqc 检查其质量在LB琼脂板中挑选的单个菌落接种的液体LB培养基中生长,并使用基因组基因组DNA纯化试剂盒(Fisher Fisher Scientifip,France,France)使用基因组基因组DNA纯化的基因组DNA,并使用手机的推荐并评估了双重态度(There the)。量子液计(Thermo Fisher Scientifim,美国)和1%琼脂糖凝胶电泳。使用Illumina Nextera XT DNA库准备套件制备了测序库,按照制造商的协议。在Miseq仪器(LMSM基因组平台,Rouen Normandy University,Evreux,France,France,France)上进行了测序,并使用Miseq Reagent Kit Kit Kit v.3(2 250 BP)进行了双指数配对末端读数。默认参数用于所有软件,除非另有说明。使用Trimmomatic V.0.36(4)对读数进行修剪,并使用Multiqc
Mark Wang 是 Illumina 副总裁兼测序平台主管,负责管理全球工程和系统集成部门,开发用于研究和临床用途的下一代 DNA 测序系统。过去十年来,Mark 一直参与 Illumina 测序仪器平台的开发,包括 HiSeq、MiSeq、NextSeq、NovaSeq 和 iSeq,以及 Illumina 的微阵列产品(包括 iScan)。加入 Illumina 之前,Mark 曾在 Genoptix 和 Ziva 领导新型光子和微流体技术的研究。他拥有加州大学圣地亚哥分校电气工程博士学位和斯坦福大学物理学学士学位,并拥有 20 项美国专利。