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结合工程化的 FnCas9 和扩展的 gRNA，实现 PAM 灵活、稳健且核碱基特异性的编辑和诊断
CRISPR 疗法的临床成功取决于 Cas 蛋白的安全性和有效性。来自新凶手弗朗西斯菌 (FnCas9) 的 Cas9 对错配底物的亲和力可以忽略不计，这使得它即使在结合水平上也能以非常高的精度区分 DNA 中的脱靶。然而，它的细胞靶向效率很低，限制了它在治疗应用中的使用。在这里，我们合理地设计了蛋白质以开发增强的 FnCas9 (enFnCas9) 变体，并将其细胞编辑活性扩展到以前无法访问的基因组位点。值得注意的是，一些变体释放了从 NGG 到 NGR/NRG 的原间隔区相邻基序 (PAM) 约束，使其在人类基因组位点上的可访问性增加了约 3.5 倍。enFnCas9 蛋白在体外和细胞中都具有单一错配特异性，从而扩大了基于 FnCas9 的 CRISPR 诊断的靶标范围，用于检测点突变和致病 DNA 特征。重要的是，它们在编辑效率、敲入率和脱靶特异性方面比其他经过设计的 SpCas9 高保真版本（SpCas9-HF1 和 eSpCas9）更胜一筹。值得注意的是，enFnCas9 变体可以与延长长度的 gRNA 结合使用，在 PAM 约束的规范碱基编辑器无法访问的位点进行强大的碱基编辑。最后，我们展示了使用 enFnCas9 腺嘌呤碱基编辑器完全纠正患者衍生的 iPSC 中的疾病特异性视网膜色素变性突变，突出了其在治疗和诊断中的广泛应用。
市审计办公室
2023 年 SEP 投资组合成就 公用事业公司完成了六个 NGG 的安装和调试，并继续扩建三个变电站和输电线路，以支持 Drake 煤电厂的退役，以及增加系统可靠性并支持未来增长。公用事业公司于 2023 年 6 月向公用事业委员会提交了其更新的电力综合资源计划 (EIRP)。EIRP 解决了满足修订后的监管国家要求以减少温室气体 (GHG) 排放并满足到 2050 年预计的负荷增长的计划。为了实现其温室气体减排目标和不断增长的电力需求，公用事业公司计划从 2026 年开始增加新的发电和存储容量。目前正在制定征求建议书，以从太阳能、风能、电池存储和天然气发电中获取更多兆瓦的新一代发电量。由于设计改进、供应链问题和疫情影响，2023 年的实际成本高于最初预算。2023 年预算的年度运营财务计划为 SEP 投资组合 44,796,630 美元。实际支出总额为 64,229,279 美元。一些计划中的 2023 年项目支出被转移到未来几年，以帮助平衡预算。
ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶
ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶是一种融合蛋白，由增强型绿色荧光蛋白 (eGFP) 和来自化脓性链球菌的野生型 Cas9 重组蛋白组成；它包含一个 C 端连接的 eGFP 分子。ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶需要与向导 RNA（例如 ArciTect™ sgRNA（目录号 #200-0013）或由 ArciTect™ tracrRNA（目录号 #76016）和 ArciTect™ crRNA（目录号 #76010）组成的双链）结合，以形成核糖核蛋白 (RNP) 复合物。该 RNP 复合物在基因组中的位点特定位置产生双链断裂。 ArciTect™ Cas9-eGFP 核酸酶还在 N 端含有核定位信号，确保 RNP 复合物转位至细胞核，从而提高基因组编辑的效率。由于 RNP 复合物在转染后完全发挥作用，因此在转位至细胞核后可立即发挥作用。RNP 复合物在 48 小时内降解，为基因组编辑提供了充足的时间，同时减少了 RNP 复合物持续存在可能导致的脱靶效应。使用 RNP 系统还可以避免生成稳定的 Cas9 表达细胞系的繁琐过程，从而节省时间并降低由于可诱导表达系统泄漏而导致脱靶效应的风险。化脓性链球菌 Cas9 使用原间隔区相邻基序 (PAM) 序列 NGG（其中 N 可以是任何核苷酸）。如果靶序列下游没有基因组 PAM 位点，酶就不会裂解。
具有PAM灵活性的工程精选编辑
为了将PE2变体的活性与野生型PE2的活性进行比较，我们设计了PEGRNA，它可以针对35个基因组基因座NGN PAM。PEGRNA建议使用引物结合位点（PBS）和RT模板（13 NT PBS和11〜14 NT RT模板）的长度，并经过随机设计以在目标基因组基因座中安装插入，缺失和取代。我们使用单链DNA组装方法8（补充注释1）更有效地构造了PegrNA。使用这些PEGRNA，我们检查了HEK293T细胞中六种PE2变体和野生型PE2的主要编辑活性（图1A-C和补充表1）。正如预期的那样，野生型PE2主要在NGG PAM站点（在9个站点中的7个活性，在UBE3A-3+5G> C位点上活跃，高达23.8％，在NGA PAM站点上有一定的认可（在9个地点的4个地点，最高22.9％的ATC and cut）和公共ng> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> c> （在8个站点中的0个中活跃）或NGT位点（在9个站点中的0个位置活跃）。相反，PE2-NG，PE2-SPG和PE2-SPRY变体可以编辑NGN位点（PE2-NG：在34个站点中的24个，PE2-SPG中有效，PE2-SPG：在35个站点中的26个站点中活跃，PE2-SPRY，PE2-SPRY：活动中的24个站点中的24个站点中的24个站点）。与先前的研究6，PE2-NG变体相比，NGC PAM位点的活性相对较低，与NGD相比（其中D是A，G或T）PAM位点，并且与其他PE2变体相比，PE2-SPG变体在NGH处显示出最高的活性（其中H是A，C，C，T）PEAM位点（其中PE2）在其他PE2变体中（Fige2 variant）（FIGINIANT（FIGINIANT）（FIGINIANT（FIGINING）（FIGINIANT（FIGINID）（FIGINIANT（FIGINID）（FIGINIANT（FIGINID）（FIGINIANT（FIGINID）（图。1C和补充图1）。
能源和基础设施资本市场通讯
能源€毫米07/03/2022 07/03/2022定价日期，发行人穆斯迪的标准票成熟大小（€mm）优惠券bid i spread 5 bid ytm6 22/01/2021/2021 2i rete .5 99 spa 20％20％IT 66 11/01/2022 E.On se de ba bbb bb bb bb /2021 e.on e e de baa2 BBB 2028 600 0.100％SE 309109 DE 36/420 BBB 0.500 0.750％28.91 0.97 31/10/2019 e.on se de baa2 se de baa2 bbb 2031 500 0.625％0.625％44.03 1.17 30/01/01/20/20/20/fi 2 ENEL INTL NV NL BAA1 BBB+ 2035 750 1.250％90.42 1.75 10/10/2019 Enel Finance Intl NV NL BAA1 5.601/17015％/2021 ENEL FINEL FINE BAA1 BBB+ 2029 103043％0 84.44 1.46 07/10/2019 ENI SPA IT BAA1 A- 2034 750 1.000％77.36 1.61 01/04/2020 Iberdrollola Finanzas Sau es baa1 baa1 baa1 bbb+ 50.7/2025 Algas spa IT BAA2 BBB+（fitch）2031 500 19000％11080％F 1108G6 BBB- 2082 750 2.125％284.55 3.29 28/08/2019 NGG Finance UK BA1 2022 RTE运输网络2034 850％35.49 1.18 20/09/2018 RTE。 B+ 2034 600 1.000％89.87 1.74 26/03/2020 SUEZ FR BAA1 NR 2027 850 1.250％34.75 0.75 0.75 0.75
植物における相同组换えを介した精密ゲノム编集...
CRISPR/CAS系统被发现是一种细菌免疫机制（一种驱除外毒病毒等的机制），而CRISPR/CAS9（近年来一直在世界上使用最广泛的CRISPR/CAS9）来自链球菌为增生链球菌（SPCAS9）。该系统由CAS9，一种裂解双链DNA的酶（内切酶）和一个称为“ Guide RNA（GRNA）”的短RNA分子组成。 GRNA由一个20碱基的序列互补，与位于5'端的目标序列和作为CAS9的支架的序列，当Cas9与脚手架序列结合时，形成了Cas9-grna络合物。为了使CAS9识别目标序列，需要一个称为原始的基序（PAM）的特定序列，将序列与GRNA的5'末端的20个基部互补（在SPCAS9的情况下为NGG），并且需要Cas9-guide RNA与指导rna + p Douplence rebs crement cremence extrent crement crement crements extrest rebists的互补序列的位置结合的位置。 CRISPR/CAS9系统不仅用于切割DNA，而且通过将各种效应子与Cas9蛋白相结合，而CAS9蛋白的DNA裂解活性部分或完全不足，而不需要DNA双链断裂的基因组编辑技术是一个接一个地开发的。 One of these is a technology called Prime editing, in which a fusion protein in which reverse transcriptase is linked to a Cas9 (nickase-type Cas9, nCas9) protein that has partially deficient in DNA cleavage activity and an RNA molecule in which a sequence that forms the template for reverse transcriptase is linked to the 3' end of gRNA, allowing an arbitrary modification to the target gene using RNA as a template.
莱茵衣藻乙酰辅酶A羧化酶（CrACCase）的计算机基因组编辑鉴定和功能蛋白变化
莱茵衣藻中的乙酰辅酶a羧化酶（CrACCase）是一种编码三酰甘油（TAG）和脂质（油体）合成的基因。CrACCase基因研究很少，尚未进行过计算机或体内遗传改造。在本研究中，我们为基因组编辑，特别是CrACCase提供了生物信息学精确信息。本研究旨在构建sgRNA并预测CrACCase假定突变蛋白的功能区域。根据分子鉴定结果，可以对最佳的CrACCase（GeneBank XM_001703135）进行计算机遗传改造。本研究中最佳的潜在 sgRNA 构建体为 GCGTCTGCTCAATCACACGGCGG、TTGAGGTCGGAACTCCAGCGG 和 AGGCAATACCCTCAATTGGGTGG，效率值分别为 79.27%、68.25% 和 65.17%。获得的最佳寡核苷酸 sgRNA 具有一个带有 NGG 的原间隔区相邻基序 (PAM) 位点，尤其是 CGG 和 TGG 的形式。工程化的 CrACCase 基因突变的位置位于莱茵衣藻基因组的 XM_001703135.1:1089 区域，尤其是在负链中。预测 CrACCase 蛋白具有 ACC 的羧基转移酶亚基、假定 PCC 的羧基转移酶亚基、酵母乙酰辅酶 A 羧化酶的人源化羧基转移酶结构域和乙酰辅酶 A 羧化酶的结构。 CrACCase 基因中的移码突变的变化影响了残基 D:C 92、95、111 和 114 处配体-蛋白结合位点功能区的结构变化，这些位点是锌离子结合位点。这种结构变化导致 CrACCase 蛋白的功能发生变化。这种生物信息学信息对于将来对 CrACCase 进行体内基因组编辑非常重要，这样就可以获得具有最高 TAG 产量或最高生物柴油（油体）产量的突变体。分子生物学家和生物技术专家可以将对莱茵衣藻中 CrACCase 基因的操纵应用于脂质百分比最高的其他微藻生物，以增加未来的生物能源产量。
crispr/cas9纸模型
cas9将切割的地方由称为指导RNA的短RNA分子确定，该指导RNA与CAS蛋白结合（图1）。引导RNA与Cas9结合后，该复合物将基因组扫描为一个称为PAM的三个碱基序列。cas9 pam序列为5'ngg 3'，其中n可以是任何碱基。当Cas9遇到PAM序列时，它会解压缩DNA，将其分成单链。cas9使用引导RNA确定是否切割DNA。在引导RNA的一端是约20个碱基，确定将切割哪种DNA序列Cas9。如果引导RNA中的20个碱基序列与DNA互补，则CAS9将切割DNA的两个链。如果引导RNA与DNA不匹配，则复合物将移至下一个PAM位点，然后将双螺旋式拉链重新拉链为双链形式。将Cas9用作基因编辑工具的诀窍是，科学家可以自定义〜20个核苷酸序列，以将Cas9靶向DNA的特定区域，从根本上允许它们编程Cas9可以切割的地方。在真核细胞中，一旦CAS9切割了靶DNA，该细胞将尝试修复断裂（图2）。一个常见的修复是通过称为非同源末端连接（NHEJ）的过程，将DNA破裂的DNA破裂链重新构成。当细胞执行此操作时，通常会添加或去除几个DNA碱基。这些行为类似于DNA代码中的错别字。尽管我们经常认为随机突变是有害的，但有时它们可以被科学家用作工具。例如，禁用基因的随机突变可以帮助科学家了解基因的功能及其所编码的蛋白质。因此，基因是CRISPR/CAS系统的常见用途。
能源和基础设施资本市场通讯
ENERGY €MM 28/12/21 28/12/21 Pricing date Issuer Country Moody's S&P Maturity Size (€MM) Coupon Bid I Spread Bid YTM 22/01/2021 2I RETE GAS 2 SPA IT 10. 59/50% 2031 01/2021 E.ON SE DE Baa2 BBB 2028 600 0.100% 23.51 0.33 09/01/2020 E.ON SE DE Baa2 BBB 2030 500 0.750% 20.45 SE 0.41.ON 31 .625% 30.23 0.53 30/01/2020 ELENIA VERKKO OYJ FI NR BBB+ 2027 500 0.375% 43.74 0.44 10/10/2019 ENEL FINANCE 1. 30 INTL 202% NV .12 0.39 21/09/2021 ENEL FINANCE INTL NV NL Baa1 BBB+ 2026 1,250 0.000% 29.81 0.26 21/09/2021 ENEL FINANCE INTL 80% B40 NL, 2021 Baa 0.97 21/09/2021 ENEL FINANCE INTL NV NL Baa1 BBB+ 2029 1,000 0.375% 45.66 0.57 07/04/2020 ENERGIAS DE PORTUGAL 26 250 PT 1. 379 27 BBB 3/01/2020 ENERGIES DE PORTUGAL SA PT Ba2 BB+ 2080 750 1,700% 195.32 1.85 20/10/2021 ENGIE SA FR Baa1 BBB+ SA FR Baa1 BBB+ 2029 750 0.375% 31.82 0.46 16/01/2020 ENI SPA IT Baa1 A- 2030 1,000 0.625% 47.87 0.610 07/a% EPA-201 30.01 0.66 01/04/2020 IBERDROLA FINANZAS SAU ES Baa1 BBB+ 2025 750 0.875% 4.41 -0.09 05/02/2021 ITALGAS SPA IT Baa2 020. 5021 330) 02/12/2019 ITALGAS SPA IT Baa2 BBB+ (Fitch) 2031 500 1.000% 57.92 0.83 13/01/2020 NATL GRID ELECT TRANS UK Baa1 BBB+ 2025 5.5902 0.2 URGY FINANCE BV NL BBB+ (Fitch) BBB 2026 1,000 1.250% 14.65 0.06 28/08/2019 NGG FINANCE PLC UK Ba1 BBB- 2082 750 2.184 LC 20/186. Ba1 BBB- 2079 500 1.625% 145.52 1.26 09/01/2020 RED ELECTRICA FIN SA UNI ES A- (Fitch) A- 2028 700 0.375% 7.03 RT080 RTERA 20 38 500 2,125% 50.71 0.95 20/09/2018 RTE TRANSPORT NETWORK FR NR A 2030 500 1,500% 35.18 0.52 27/11/20 BBE 20 SERVICES M 1.661% 54.06 0.52 05/09/2019 SNAM SPA IT Baa2 BBB+ 2034 600 1.000% 56.56 0.92 26/03/2020 SUEZ FR Baa1 .212 0% 2027 2027
智能家居电源管理算法，用电动汽车和光伏面板“ 2279
CRISPR/CAS9系统是一种有效的基因组编辑工具，具有简单性和高效率的优势。全基因组识别和编辑位点的特异性分析是减轻CRISPR/CAS9脱靶效应风险的有效方法，并且已在几种植物物种中应用，但尚未在胡椒中报道。在本研究中，我们首先根据“ Zunla-1”参考基因组确定了全基因组CRISPR/ CAS9编辑位点，然后通过全基因组比对评估了CRISPR/ CAS9编辑位点的特异性。结果表明，总共有603,202,314个CRISPR/CAS9编辑站点，包括229,909,837（〜38.11％）NGG-PAM站点和373,292,477（〜61.89％）NAG-PAM位点，在Pepper Genome中可检测到荷兰nag-pam站点的表现，并具有共制的表现。通过全基因组比对分析鉴定出29,623,855个高度特异性的NGG-PAM位点。有26,699,38（〜90.13％）位于基因间区域的高度特异性NGG-PAM位点，这是基因区域数量的9.13倍，但遗传区域的平均密度高于基因间区域的平均密度。更重要的是，在35,336个注释的基因中，有34,251（〜96.93％）在其前exon中表现出至少一个高度高度的NGG-PAM位点，90.50％的注释基因中的90.50％至少表现出了至少4个高度特定的NGG PAM位点，并表明了这一非常具体的CRIS/CASS 9编辑，并在其中编辑了这一编辑。有利于CRISPR/cas9在胡椒中的脱靶效应最小化。