XiaoMi-AI文件搜索系统
World File Search SystemNHEJ
（缺少）DNA双链断休息途径在V（d）J重组期间选择
DNA双链断裂（DSB）是可以通过多种DNA修复途径修复的剧毒病变。多个因素可能会影响修复对给定途径的选择和限制，以保证维持基因组完整性。在V（D）J重组期间，RAG诱导的DSB（几乎）是通过非同理端连接（NHEJ）途径仅修复的，以实现抗原受体基因多样性的益处。在这里，我们回顾了将RAG生成的DSB修复到NHEJ的各种参数，包括RAG核酸酶产生的DNA DSB末端的特殊性，裂解后突触复合物的建立和维护，以及DNA末端的DNA末端的末端抗切除和（Microtro）的人体学修复。在这种生理背景下，我们强调某些DSB的DNA修复途径选择有限。
使用集成有机电化学晶体管的选择性离子检测
将靶向修饰引入植物基因组的过程涉及三个常见步骤：识别目标DNA序列，诱导断裂和修复。首先，工程核酸酶的序列识别模块重新识别目标DNA序列。接下来，核酸酶与靶DNA序列结合，并创建双链断裂（DSB）或单链断裂。最后，通过内源性DNA修复途径或通过工程机制来修复DNA断裂。主要的DNA修复路径包括非同源末端连接（NHEJ）和同源指导修复（HDR）（Symington and Gautier 2011）。这些途径之间的一个显着差异是，尽管NHEJ是一个容易出错的修复过程，并且通常导致突变引入突变，例如小插入和缺失（Indels），但HDR会导致精确的维修。这些基本原则是当前正在使用的所有基因组编辑技术的基础，工具之间的关键差异
最初发表于：Heeb，Laura V；塔斯科帕兰，贝图尔；卡特苏拉斯（Katsoulas），安东尼奥斯（Antonios）；贝芬格，米哈尔；克拉维恩，皮埃尔-阿兰；狗头人，塞巴斯蒂安；古普塔，
免疫抑制分子程序性细胞死亡配体 1 (PD-L1) 已被证明在自身免疫、感染和癌症等病理中发挥作用。PD-L1 不仅在癌细胞上表达，而且在未转化宿主细胞上的表达也与癌症进展有关。小鼠系统中 PD-L1 缺陷的产生使我们能够专门研究 PD-L1 在生理过程和疾病中的作用。最通用且最易于使用的位点特异性基因编辑工具之一是 CRISPR/Cas9 系统，它基于 RNA 引导的核酸酶系统。与其前身锌指核酸酶或转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN) 类似，CRISPR/Cas9 催化双链 DNA 断裂，这可能导致由于非同源末端连接 (NHEJ) 的随机核苷酸插入或缺失而导致的移码突变。此外，尽管不太常见，但 CRISPR/Cas9 可以在存在合适模板的情况下通过同源定向修复 (HDR) 导致插入确定的序列。在这里，我们描述了使用 CRISPR/Cas9 在小鼠 C57BL/6 背景下敲除 PD-L1 的方案。外显子 3 的靶向结合 HindIII 限制位点的插入会导致过早终止密码子和功能丧失表型。我们描述了靶向策略以及创始者筛选、基因分型和表型。与基于 NHEJ 的策略相比，所提出的方法可产生具有与 NHEJ 相当的效率和时间线的确定终止密码子，生成方便的创始者筛选和基因分型选项，并且可以快速适应其他目标。
利用DSB维修以促进有效的同源性...
Prime编辑最近作为用于精确基因组编辑的下一代方法。在这里，我们利用DNA双链断裂（DSB）修复来开发两种新型策略，这些策略使用基于SP Cas9核酸酶的Prime Editor（PEN）安装精确的基因组插入。我们首先证明，与常规的Prime编辑指南RNA（PEGRNA）相连，可以有效地通过依赖同源性的DSB修复机制促进短基因组插入。虽然笔编辑导致副产品的水平增加，但它挽救了与基于Nickase的Prime编辑器表现不佳的Pegrnas。我们还提出了一种小分子方法，该方法产生了笔编辑的产物纯度。接下来，我们通过设计一个单个启动插入GRNA（springRNA）来开发同源性独立笔编辑策略，该插入式插入式插入（SpringRNA）通过非同源端连接途径（NHEJ）安装DSB的基因组插入。最后，我们表明，在DSB上进行的笔介导的插入阻止了Cas9诱导的大染色体缺失，并提供了证据表明连续CAS9介导的切割是Cas9诱导的大缺失的一种机制之一。总的来说，这项工作通过利用包括NHEJ在内的不同的DNA修复机制来扩展当前的Prime编辑工具箱，NHEJ代表了哺乳动物细胞中DSB修复的主要途径。
非同源末端连接是 CRISPR/Cas 的关键……
尽管成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 (Cas) 介导的基因编辑已经彻底改变了生物学和植物育种，但大规模的可遗传植物染色体重组仍处于起步阶段。现在可以实现染色体内的重复和倒位，以及染色体之间的易位。随后，可以破坏或新建遗传连锁。此外，染色体上基因的顺序也可以改变。虽然自然染色体重组在减数分裂过程中通过同源重组发生，但 CRISPR/Cas 介导的染色体重排最好通过利用体细胞中的非同源末端连接 (NHEJ) 途径获得。NHEJ 可细分为经典 (cNHEJ) 和替代 NHEJ (aNHEJ) 途径，它们部分地以拮抗方式运作。 cNHEJ 通路不仅可以保护断裂的 DNA 末端免于降解，还可以抑制先前未连接的断裂末端的连接。因此，在没有 cNHEJ 的情况下，可以获得更多的倒位或易位，这可以归因于无限制地使用 aNHEJ 通路进行双链断裂 (DSB) 修复。与倒位或易位相反，短串联重复可以通过 Cas9 切口酶由成对的单链断裂产生。有趣的是，cNHEJ 通路对于这些类型的重复至关重要，而 aNHEJ 则是补丁插入所必需的，补丁插入也可以在 DSB 修复期间形成。由于染色体工程不仅在模式植物拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 中实现，而且在作物玉米 (Zea mays) 中也实现，我们预计这项技术将很快改变育种过程。
p120 HDR 质粒 (h): sc-400943-HDR
含有由 CRISPR/Cas9 系统产生的双链断裂 (DSB) 的 DNA 可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 途径进行修复 (1,2,3)。NHEJ 修复途径在切割位点引入非特异性插入或缺失，而 HDR 途径允许在 DSB 位点进行精确的基因编辑 (1,2,3)。靶向特异性 HDR 质粒为 DSB 提供 DNA 修复模板，当与 CRISPR/Cas9 KO 质粒共转染时，能够在发生 Cas9 诱导的 DNA 切割的位置插入特定的选择标记 (1,2)。HDR 质粒可以整合红色荧光蛋白 (RFP) 基因以直观地确认转染，并整合抗生素抗性基因 (嘌呤霉素) 以选择含有成功 CRISPR/Cas9 双链断裂的细胞。嘌呤霉素抗性和 RFP 编码基因两侧是两个 LoxP 位点，这些位点可被 Cre 载体识别，之后可利用该位点从基因组 DNA 中去除这些选择标记 (4,5)。
RNA：Okazaki片段的DNA杂交造成了ku介导的障碍物的复制效果
非同源最终连接（NHEJ）因素在复制叉保护，重新启动和维修中。在这里，我们确定了一种与RNA相关的机制：在裂变酵母中建立NHEJ因子KU介导的障碍物的DNA杂种。rNase H活性促进新生的链降解和复制重新开始，RNase H2在处理RNA中的重要作用：DNA杂种以克服新生链降解的KU级杂种。rNase H2与MRN-CTP1轴合作，以KU的方式维持对复制应激的抗性。从机械上讲，新生链降解中RNAseH2的需求需要培养基活性，该活动允许建立KU级驻射击器exo1，而损害Okazaki碎片的成熟会加强KU驻式甲壳。最后，复制应力以原始酶依赖性方式诱导KU灶，并有利于KU结合与RNA：DNA杂交。我们提出了RNA的功能：DNA杂交源自冈崎片段的DNA杂交，以控制KU驻式核能指定核酸酶的要求，以使分叉切除。
精准基因组编辑技术与应用
CRISPR/Cas 系统，特别是 CRISPR/Cas9（Jinek 等人，2012；Cong 等人，2013），已被开发为一个强大而多功能的平台，用于操作各种物种的基因组。近年来，许多报告表明其在人类基因治疗和生命科学研究以及动植物育种方面具有强大的潜在应用。本研究主题“精准基因组编辑技术和应用”中的集合可能就是明证。通常，CRISPR/Cas9 核酸酶用于切割目标基因组 DNA 以产生位点特异性双链断裂 (DSB)，主要通过非同源末端连接 (NHEJ) 修复，或在较小程度上通过同源定向修复 (HDR) 修复。经典的 NHEJ 修复途径可产生小的插入或缺失 (indel)，通过在开放阅读框 (ORF) 中引入移码导致目标编码基因的功能丧失。NHEJ 诱变是一种非常流行的基因操作策略。除了经典的 NHEJ 之外，替代或准确的 NHEJ 介导的修复可以实现精确的基因组 DNA 缺失（Guo et al., 2018; Shou et al., 2018）。Chao 等人和 Zhao 等人在本研究主题中的两篇论文分别描述了等位基因特异性敲除和双基因敲除小鼠模型的制造，用于快速疾病基因验证和人类异种移植研究。N6-甲基腺苷 (m6A) 是一种成熟的真核 mRNA 表观遗传修饰。越来越多的研究发现了 m6A 甲基化的意义，这催生了“表观转录组学”这一新兴领域。本卷中的另一篇文章（ Huang 等人）描述了小鼠精原细胞 GC-1 细胞中脂肪质量和肥胖相关（ Fto ）基因的敲除研究，该基因已被证明作为 m6A 去甲基化酶作用于表观转录组（ Li 等人，2017 年； Lin 等人，2017 年）。另一方面，HDR 修复途径依赖于同源供体 DNA 在 DSB 位点产生靶向基因敲入或在两个 DSB 位点之间产生基因替换。精确的点突变和设计的小插入/缺失也可以通过这种方法实现。本专题中的一篇论文介绍了利用CRISPR/Cas9介导的HDR在人诱导性多能干细胞（iPSC）中精准校正Rett综合征（RTT）中甲基-CpG结合蛋白2（MECP2）基因的努力。该报道为基于iPSC的疾病建模和基因校正治疗提供了参考（Le等）。虽然基于HDR的基因组可以实现基因插入和精准替换，但在精准编辑过程中仍面临一些缺点，包括HDR效率低、双等位基因靶向失败、正向选择的复杂性以及选择标记的重新删除。
ßA1-晶体蛋白 HDR 质粒 (m): sc-419822-HDR
含有由 CRISPR/Cas9 系统产生的双链断裂 (DSB) 的 DNA 可以通过非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR) 途径进行修复 (1,2,3)。NHEJ 修复途径在切割位点引入非特异性插入或缺失，而 HDR 途径允许在 DSB 位点进行精确的基因编辑 (1,2,3)。靶向特异性 HDR 质粒为 DSB 提供 DNA 修复模板，当与 CRISPR/Cas9 KO 质粒共转染时，能够在发生 Cas9 诱导的 DNA 切割的位置插入特定的选择标记 (1,2)。HDR 质粒可以整合红色荧光蛋白 (RFP) 基因以直观地确认转染，并整合抗生素抗性基因 (嘌呤霉素) 以选择含有成功 CRISPR/Cas9 双链断裂的细胞。嘌呤霉素抗性和 RFP 编码基因两侧是两个 LoxP 位点，这些位点可被 Cre 载体识别，之后可利用该位点从基因组 DNA 中去除这些选择标记 (4,5)。
囊性纤维化患者细胞中的 P.F508del 编辑
基因组编辑方法的发展为基于病因的遗传性疾病治疗方法的开发创造了新的机遇。在这里，我们证明 CRISPR/Cas9 可以纠正囊性纤维化 (CF) 患者来源的 CFTE29o- 细胞和诱导多能干细胞 (iPSC) 中 CFTR 基因的 p.F508del 突变。我们使用了 Cas9、sgRNA 和 ssODN 的几种组合，并测量了内源性 CFTR 基因和含有 p. F508del 突变 CFTR 基因座的共转染质粒的编辑效率。CFTE29o- 细胞中 CFTR 基因中的非同源末端连接 (NHEJ) 频率从等位基因的 1.25% 到 2.54% 不等。内源性 CFTR 基因座中最好的同源定向修复 (HDR) 频率为等位基因的 1.42%。在 iPSC 中，CFTR 基因中的 NHEJ 频率从等位基因的 5.5% 到 12.13% 不等。HDR 效率最高的是等位基因的 2.38%。我们的结果表明，在 CF 患者来源的 iPSC 中使用 CRISPR/Cas9 进行 p.F508del 突变编辑是一种相对罕见的事件，应进行后续细胞选择和培养。