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社论：CRISPR 及其他：治疗应用中基因校正的尖端技术
基因编辑有望通过直接纠正致病变异来最终治愈遗传病。然而，首次临床试验追逐的是“唾手可得的果实”，使用的编辑策略依赖于基因破坏，即通过引入双链 DNA 断裂，导致 NHEJ 通路插入和删除 (indel)。由于 NHEJ 在整个细胞周期和默认 DNA 修复通路中都处于组成性活跃状态，因此与同源定向修复 (HDR) 相比，这是迄今为止最有效的传统基因编辑类型。HDR 依赖于外源修复模板的递送，并且该通路仅在细胞周期的 S 和 G2 期活跃。这两个参数对 HDR 的临床应用构成了挑战，因为外源 DNA 在大多数治疗相关细胞类型中都是有毒的，并且 NHEJ 和 HDR 之间的固有竞争可能成为瓶颈。然而，HDR 的优势在于能够对基因组进行精确编辑，从而代表真正的基因编辑，并可控制结果。尽管如此，在这两种方式中，DNA 断裂都被认为是潜在的基因毒性来源，因为存在脱靶编辑和染色体畸变（如易位和染色体碎裂）的可能性。依赖于 DNA 单链切口的下一代基因编辑工具（如 Base Editing 和 Prime Editing）降低了此类有害事件的风险，但它们可以生成的编辑范围仍然有限（Anzalone 等人，2020 年）。基于 CRISPR 相关转座酶或 CRISPR 指导的整合酶的最新类型的编辑器可以促进更大规模的编辑，但仍在开发中，尚不成熟，无法用于临床实施（Yarnall 等人，2022 年；Tou 等人，2023 年）。这个快速发展的工具箱有望扩大基于 CRISPR 的工具和其他位点特异性工程核酸酶在治疗人类疾病中的应用。然而，在实现精准基因校正的这一过程中，仍存在一些尚未解决的问题和挑战需要克服，其中一些问题我们希望通过基于 CRISPR 系统或其他工程化位点特异性核酸酶的治疗性基因校正策略这一研究课题来解决。本研究课题涵盖了一系列贡献，包括精准基因工程的重大科学进展以及专家对最新进展的看法。
方案 使用 CRISPR/Cas9 在马克斯克鲁维酵母中进行无标记基因敲除和敲低的方案
人们对食品和工业酵母马克斯克鲁维酵母的菌株工程越来越感兴趣，不同的研究小组已经描述并使用了许多 CRISPR/Cas9 系统。我们开发的方法允许使用细胞的内源性 DNA 修复机制非常快速有效地灭活靶基因。我们使用的菌株和质粒是免费提供的，在这里我们提供了一套集成的方案，可以轻松灭活基因并将 DNA 片段精确整合到基因组中，例如用于启动子替换、等位基因交换或引入点突变。这些方案使用 Cas9/gRNA 表达质粒 pUCC001 和 Golden Gate 组装来对靶向序列进行分子克隆。提供了一组全基因组的靶向序列。在野生型菌株或缺乏非同源末端连接 (NHEJ) DNA 修复的菌株中使用这些质粒，第一组方案解释了如何在精确目标处引入插入/缺失（NHEJ 介导）或精确缺失（同源性依赖性修复 (HDR) 介导）。第二组方案描述了如何交换启动子或编码序列以产生重编程基因。这些方法不需要使用显性或营养缺陷型标记基因，因此产生的菌株不含标记。这些方案已在多个 K. marxianus 菌株中进行了测试，非常简单，可以在任何分子生物学实验室中进行，无需专门的设备。
基准
CRISPR/Cas9 系统天然存在于细菌和古细菌免疫系统中 [ 1 ] ；然而，它已被改造用于真核生物，成为获得诺贝尔奖的基因组编辑系统 [ 2,3 ] 。CRISPR/Cas9 系统使用 gRNA 将 Cas9 核酸酶引导至 NGG 原型间隔区相邻基序序列附近的特定靶标。然后，Cas9 切割 DNA，细胞的天然 DNA 损伤修复机制修复双链断裂。在 CRISPR/Cas9 编辑过程中，用于敲除和修饰靶基因的两种主要修复途径是非同源末端连接 (NHEJ) 和同源定向修复途径。当供体 DNA 模板不可用时，NHEJ 是修复双链断裂的主要选择，这使其成为 CRIPSR/Cas9 敲除实验的一个不错选择。核苷酸的丢失和获得是 NHEJ 介导的修复过程中的常见现象，而敲除则来自编码序列的移动。同源定向修复基于供体 DNA 模板的可用性，主要用于编码或非编码序列中的定制基因修饰 [4,5]。CRISPR/Cas9 系统越来越多地用于高级疗法，包括细胞和基因疗法，前景广阔（例如，用于治疗镰状细胞病的 CRISPR 测试）[6,7]。许多用于实现 CRISPR/Cas9 核酸酶 RNA 引导的基因组编辑的商业产品可通过多种递送方式获得。这些产品包括病毒、质粒、mRNA 和 RNP 中编码的 DNA。此外，CRISPR gRNA 可以分为两部分递送，即 crRNA 和 tracrRNA，或作为 sgRNA。多种细菌物种提供 CAS 蛋白选择；常用的一种是化脓性链球菌 Cas9。同样，这些分子进入细胞的方式也有很多，包括病毒载体（如慢病毒和腺相关病毒载体）和化学方法（如脂质、注射和电穿孔）[8,9]。尽管 CRISPR/Cas9 是一种令人兴奋的基因组编辑工具，但在使用 CRISPR/Cas9 编辑细胞后，关于基因组和表型稳定性的纵向数据有限。目前有几份报告提供的证据表明，CRISPR/Cas9 编辑还可能带来其他意想不到的长期变化[10–12]。此外，在选择编辑的细胞亚群时可能会出现遗传瓶颈。因此，对用于细胞和基因疗法等高级疗法的编辑细胞进行表征至关重要，因为这种疗法通常涉及给患者施用编辑过的细胞群[13]。
发育阶段，组织类型和性别对果蝇果蝇中DNA双链破裂修复的影响
精确修复DNA双链断裂（DSB）对于维持基因组完整性至关重要，因为无法修复DSB会导致细胞死亡。该细胞已经发展了DSB修复的两种主要机制：非同源最终连接（NHEJ）和同源性定向修复（HDR），其中包括单链退火（SSA）和同源重组（HR）。虽然已知某些因素（例如年龄和染色质的状态）会影响DSB修复途径的选择，但在多细胞生物中尚未阐明发育阶段，组织类型和性别的作用。通过分子分析DR-sophila melanogaster在各种胚胎发育阶段，幼虫和成人组织的影响，通过分子分析DR-白色测定法（Tide）。在维持规范（G1/S/S/G2/M）细胞周期的组织中，HR修复的比例最高，并且在两个末端分化和多倍体组织中都被抑制。为了确定性别对修复途径选择的影响，分析了男性和女性的不同组织中的修复。当分子检查含有大部分细胞的组织时，雄性和女性会占据相似的HR和NHEJ比例。然而，当使用DR-White分析的表型分析对男性和雌性前生殖细胞中DSB修复进行分析时，与雄性相比，女性的HR显着下降。这项研究描述了发育，组织特异性循环特征的影响，在某些情况下，性别对DSB修复结果的影响，强调了多细胞生物的修复的复杂性。
CRISPR/CAS9方法促进了在Debaromyces Hansenii
卤素和渗透剂酵母菌dealomyces Hansenii具有很高的细胞工厂应用潜力，因为它抵抗了严峻的环境因素以及与广泛的底物范围的兼容性。但是，目前可用的遗传技术不允许汉斯内尼作为细胞工厂的全部潜力。此外，大多数当前可用的工具都依赖于不适合野生型原型营养菌株的补充营养标记。此外，当需要精确的基因靶向时，首选的非同源末端连接（NHEJ）DNA损伤修复机制会带来进一步的挑战。在这项研究中，我们提出了一种新型的基于质粒的CRISPR CUG /CAS9方法，用于易于有效的基因编辑。我们的工具集设计基于主要标记，并促进了表达Cas9和单个或多个单个指南RNA（SGRNA）的矢量的快速组装，这些载体即使在原养菌株中也为多路复用基因工程提供了可能性。此外，我们已经构建了缺乏的nhej hansenii，使我们的crispr cug /cas9工具能够支持点突变和单个 /双基因缺失的高效引入。重要的是，我们还证明了90-NT单链DNA寡核苷酸足以直接修复SGRNA-CAS9诱导的DNA断裂，从而导致精确的编辑达到100％效率。总而言之，本研究中开发的工具将在D. Hansenii中大大推进基础和应用研究。此外，我们设想我们的工具可以迅速适应其他非惯性酵母菌物种的基因编辑，包括属于CUG的酵母菌物种。
基因组编辑生物文件草案
bp：碱基对 CRISPR：成簇的规律间隔的短回文重复序列 Cas：CRISPR 相关系统 DNA：脱氧核糖核酸 DSB：双链断裂 GE：基因工程 GEd：基因编辑 EPA：环境保护法 HDR：同源定向修复 HR：同源重组 Indel：插入/删除 kbp：千碱基对 MN：巨核酸酶 NHEJ：非同源末端连接 nt：核苷酸 ODM：寡核苷酸定向诱变 PN：可编程核酸酶 rDNA：重组 DNA RGENs：RNA 引导的工程核酸酶 SSB：单链断裂 SDN：定点核酸酶 TALEN：转录激活因子样效应核酸酶 ZFN：锌指核酸酶 ZFP ：锌指蛋白
针对同源性定向修复进行精确基因编辑的先进趋势：小分子和改良的 CRISPR-Cas9 系统的综合回顾
摘要 简介：基于成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白 (CRISPR-Cas) 的技术通过诱导位点特异性双链断裂 (DSB) 在宿主基因组中产生靶向修饰，而位点特异性双链断裂可作为体外和体内模型中同源定向修复 (HDR) 的底物。HDR 通路可以增强外源 DNA 模板掺入 CRISPR-Cas9 介导的 DSB 位点。由于 HDR 通路的速率低，精确基因组编辑的效率降低。提高 HDR 的效率可以提供基于 CRISPR-Cas9 技术的快速、简便和准确的技术。方法：本研究概述了基于小分子和改进的 CRISPR-Cas9 系统的精确基因组编辑策略的尝试。结果：为了提高靶细胞中的 HDR 率，已经引入了几种合理的策略，例如生成 CRISPR 效应嵌合蛋白、抗 CRISPR 蛋白、用供体模板修饰的 Cas9，以及使用经过验证的合成或天然小分子来抑制非同源末端连接 (NHEJ)、刺激 HDR 或同步细胞周期。最近，高通量筛选方法已被用于鉴定与 CRISPR 系统一起可以通过 HDR 调节精确基因组编辑的小分子。结论：刺激 HDR 成分或抑制 NHEJ 可以提高 CRISPR-Cas 介导的工程系统的准确性。生成嵌合可编程内切酶提供了这种机会来引导 DNA 模板靠近 CRISPR-Cas 介导的 DSB。小分子及其衍生物还可以有效地阻断或激活某些 DNA 修复途径，并为提高 HDR 效率带来新的视角，尤其是在人类细胞中。此外，小分子库的高通量筛选可以发现更多有前景的化学物质，从而改善 HDR 效率和 CRISPR-Cas9 系统。
CRISPR CAS9和CAS12A同源指导维修的优化设计参数
CRISPR – CAS蛋白是用于在靶向基因组基因座上引入双链断裂（DSB）的RNA引导的核酸酶。DSB通过内源性细胞途径（例如非同源末端连接（NHEJ）和同源指导修复（HDR））修复。在修复过程中提供外源DNA模板，可以通过HDR途径有意，精确地掺入所需的突变。但是，与更快但准确的NHEJ介导的修复相比，HDR的维修率通常很慢。在这里，我们使用单链寡脱氧核苷酸（SSODN）供体模板描述了全面的设计注意事项和优化的高效HDR方法，用于包括S.P.Cas9，S.P。 cas9 d10a nickase和A.S. CAS12A作为核糖核蛋白（RNP）配合物传递。 针对指导RNA选择，供体链的偏好以及在供体模板中的阻止突变的掺入以防止重新切断的功能，并在新颖的在线工具中实现了HDR供体模板设计。 这些发现允许在多个哺乳动物细胞系中使用HDR进行高频率的精确修复。 工具可用性：https：//www.idtdna。com/hdrCas9，S.P。cas9 d10a nickase和A.S. CAS12A作为核糖核蛋白（RNP）配合物传递。针对指导RNA选择，供体链的偏好以及在供体模板中的阻止突变的掺入以防止重新切断的功能，并在新颖的在线工具中实现了HDR供体模板设计。这些发现允许在多个哺乳动物细胞系中使用HDR进行高频率的精确修复。工具可用性：https：//www.idtdna。com/hdr
锌指蛋白靶向霍乱毒素A（ctxA）基因...
摘要 背景与目的：本研究利用锌指核酸酶（ZFN）技术破坏霍乱毒素基因（ctxA），抑制霍乱弧菌（V. cholera）产生CT毒素。实验方法：设计一个工程化的ZFN，靶向ctxA基因的催化位点，将ZFN编码序列克隆到pKD46、pTZ57R T/A载体和E2-crimson质粒中，转化大肠杆菌（E. coli）Top10和霍乱弧菌，通过菌落计数法评估ZFN的转化效果。结果：转化后的大肠杆菌经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹实验未见表达，ctxA基因测序未见突变，pKD46-ZFN质粒聚合酶链式反应结果为阴性。用含有完整 ZFN 序列的 T/A 载体转化大肠杆菌 Top10 产生 7 个菌落，所有菌落均含有具有自连接载体的细菌。用左阵列 ZFN 转化产生 24 个菌落，其中 6 个含有具有自连接载体的细菌，18 个含有具有载体/左阵列的细菌。用含有完整 ZFN 的 E2-深红色载体转化霍乱弧菌未产生任何菌落。用左阵列载体转化产生 17 个含有具有载体/左阵列的细菌的菌落。使用蛋白质印迹分析捕获左阵列蛋白带。结论和意义：由于缺乏非同源末端连接 (NHEJ) 机制，ZFN 可能脱靶细菌基因组，从而导致致命的双链 DNA 断裂。建议开发针对细菌基因的 ZFN，具有 NHEJ 修复系统的工程包装宿主是必不可少的。关键词：ctxA 基因；基因编辑工具；霍乱弧菌；锌指核酸酶。
用于分析汇集的 CRISPR 筛选的算法基准
简介 成簇的规则间隔回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关 (Cas) 蛋白是一类由细菌编码的、RNA 引导的可编程 DNA 靶向和切割系统。由于其使用可定制的单向导 RNA (sgRNA) 的可编程特性，CRISPR-Cas 已实现强大的汇集筛选，以探索基因组范围内遗传扰动的功能。以最常用的 CRISPR-Cas9 系统为例，化脓性链球菌 Cas9 蛋白可以与 110 个核苷酸 (nt) 的 sgRNA 复合，该 sgRNA 包含一个 20 nt 序列，该序列与目标 DNA 区域互补结合并诱导双链断裂 (DSB)。基因组 DNA 上的这种切割机制会触发宿主非同源末端连接 (NHEJ) 或同源定向修复 (HDR)