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精确的 CRISPR-Cas 介导的基因修复，最大程度减少失活......
尽管 CRISPR-Cas9 是基因治疗发展的关键，但其潜在的脱靶突变仍然是一个主要问题。在这里，我们建立了一种“间隔缺口”基因校正方法，将 Cas9 D10A 切口酶与一对相距 200 到 350 bp 的 PAM-out sgRNA 相结合。结合腺相关病毒 (AAV) 血清型 6 模板递送，我们的方法可在人类造血干细胞和祖细胞（HSPC 包括长期 HSC）和 T 细胞中实现有效的 HDR，同时将 NHEJ 介导的靶突变降至最低。利用间隔缺口，我们开发了一种修复 HBB 、 ELANE 、 IL7R 和 PRF1 基因中发生的致病突变的方法。我们实现了 20% 到 50% 的基因校正效率，同时将 NHEJ 介导的靶突变降至最低。根据深入的脱靶评估，经典 CRISPR-Cas9 诱导的频繁非预期遗传改变在用间隔缺口处理的 HSPC 中显著减少或消失。因此，间隔缺口基因校正方法为基因治疗提供了更高的安全性和适用性。
整体和局部操纵 DNA 修复机制以改变造血干细胞中位点特异性基因编辑结果
血液系统的单基因疾病有可能通过体外自体干细胞移植来治疗，移植的是经过基因改造的造血干细胞和祖细胞 (HSPC)。sgRNA/Cas9 系统允许以单核苷酸分辨率精确修改基因组。然而，该系统依赖于内源性细胞 DNA 修复机制来修复 Cas9 诱导的双链断裂 (DSB)，无论是通过非同源末端连接 (NHEJ) 途径还是通过细胞周期调节的同源定向修复 (HDR) 途径。在这里，我们描述了一组异位表达的 DNA 修复因子和 Cas9 变体，评估它们在 HBB 基因座上通过 HDR 促进基因校正或通过 NHEJ 抑制基因破坏的能力。尽管 DNA 修复因子的短暂整体过度表达不会提高原代 HSPC 中基因校正的频率，但通过与 Cas9 蛋白融合将因子定位到 DSB 确实改变了修复结果，朝着微同源介导的末端连接 (MMEJ) 修复（HDR 事件）的方向发展。当可预测的基因编辑结果对于治疗成功至关重要时，这种策略可能很有用。
21 基因组编辑元数据库的开发 - 从文献中提取信息 -
– PMID：27733139（针对 FAD3 等基因的基因组编辑实验，以改善大豆籽油） – PMID：24179142（使用 NHEJ 在斑马鱼中进行敲入基因组编辑实验） – PMID：25434822（使用基因组编辑治疗 DMD 的研究） – PMID：27050479（2016 年报告在鸡中成功使用 CRISPR-Cas9 的论文）
想成为基因编辑大师吗？
为SpCas9 经过一个点突变(D10A)，此突变会导致Cas9 只能进行单股核酸裁切(SSB)。使用上必须同时引入两段gRNA，辨认邻近的区域( 需要是DNA 双股各一股)，造成两个邻近的单股DNA 断裂，才能够引发NHEJ，造成基因缺失，因此可以大幅度降低off-target， 增加专一性。
提高 HR 频率以实现植物的精确基因组编辑
基因编辑工具，例如锌指、TALEN 和 CRISPR-Cas，为整个生命之树的植物遗传改良开辟了新领域。在真核生物中，基因组编辑主要通过两种 DNA 修复途径进行：非同源末端连接 (NHEJ) 和同源重组 (HR)。NHEJ 是高等植物的主要机制，但它不可预测，并且经常导致不良突变、移码插入和缺失。通过 HR 进行的同源定向修复 (HDR) 通常是遗传工程师首选的编辑方法。HR 介导的基因编辑可以通过整合供体模板提供的序列来实现无错误编辑。然而，植物中天然 HR 的频率低是实现高效植物基因组工程的障碍。本综述总结了为增加植物细胞中 HDR 频率而实施的各种策略。这些策略包括针对双链 DNA 断裂的方法、优化供体序列、改变植物 DNA 修复机制以及影响植物 HR 频率的环境因素。通过使用和进一步完善这些方法，基于 HR 的基因编辑可能有一天会在植物中变得很常见，就像在其他系统中一样。
酵母中DNA双链断裂周围的染色质景观及其对DNA修复途径选择的影响
摘要：DNA双链断裂（DSB）是有害的DNA病变，如果无法正确修复，这会对基因组稳定性产生灾难性后果。dsb可以通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）来修复。这两种途径之间的选择取决于哪种蛋白质结合到DSB末端以及如何调节其作用。nhej启动了KU复合物与DNA末端的结合，而HR是由5'触发的DNA链的核解度降解引发的，这需要几种DNA核酸酶/解旋酶并产生单链DNA悬垂。dsb修复发生在精确组织的染色质环境中，其中DNA围绕组蛋白八聚体形成核小体。核 - 躯体对DNA末端加工和修复机械施加了障碍。修改DSB周围的染色质组织可以通过去除整个核小体的去除，这要么通过染色质重塑因子的作用，或者是通过染色质重塑因子的作用，或者通过染色体后的转换修改来允许进行正确的DSB修复，从而可以增加染色质的功能，从而增加修复enzymes对DNA的可及性。在这里，我们回顾了酵母酿酒酵母中DSB周围发生的翻译后修饰及其在DSB修复中的作用，并特别注意DSB修复途径选择。
牙科领域的CRISPR-CA
图2：上面显示的是CRISPR-CAS9机制的一般概述。在步骤1中，已经设计了一个SGRNA，以引导CAS蛋白到基因中的目标位点。在步骤2中，识别PAM序列。在步骤3中，特定的目标位点被CAS9蛋白裂解。在步骤4中，DNA中的断裂通过非同源末端连接（NHEJ）修复，这是一种在真核生物中发现的修复系统，可修复双链DNA断裂。来源：CRISPR/CAS9系统简介。（2018）。takarabio.com。https://www.takarabio.com/learning-centers/gene-https://www.takarabio.com/learning-centers/gene-
文章抑制 SHROOM1 可通过促进同源定向修复来改善体内和体外基因整合
摘要：同源重组 (HR) 常用于实现靶向基因整合，因为与微同源介导的末端连接 (MMEJ) 或非同源末端连接 (NHEJ) 相比，它具有更高的精度和可操作性。由于它只在细胞分裂期间发生，因此似乎对动物细胞和胚胎中的基因整合效率较低。在这里，我们开发了全基因组高通量筛选和随后的配对 crRNA 文库筛选，以寻找抑制同源定向修复 (HDR) 的基因。我们发现，在报告系统中，敲低 SHROOM1 的 HDR 细胞比对照细胞富集多达 4.7 倍。无论供体类型如何，下调 SHROOM1 均可显著促进人类和小鼠细胞中成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR)/CRISPR 相关蛋白 9 核酸酶 (Cas9) 切割后的基因整合。通过在微注射过程中应用 SHROOM1 siRNA，小鼠胚胎的敲入效率也可以加倍。HEK293T 细胞中 SHROOM1 缺失引起的 HDR 效率增加可被 HDR 抑制剂 YU238259 抵消，但不能被 NHEJ 抑制剂抵消。这些结果表明 SHROOM1 是一个 HDR 抑制基因，SHROOM1 敲低策略可能适用于多种应用，包括基因编辑以生成用于研究基因功能和人类疾病的细胞系和动物模型。
二肽重复蛋白抑制 C9ORF72 ALS/FTD 中的同源性指导 DNA 双链断裂修复
方法和结果：使用 DNA DSB 修复分析，我们评估了特定修复途径的效率，发现 PR、GR 和 GA 降低了非同源末端连接 (NHEJ)、单链退火 (SSA) 和微同源介导的末端连接 (MMEJ) 的效率，但不降低同源重组 (HR)。我们发现 PR 部分通过与核仁蛋白核磷蛋白 (NPM1) 结合来抑制 DNA DSB 修复。NPM1 的消耗会抑制 NHEJ 和 SSA，这表明 PR 表达细胞中 NPM1 的功能丧失会导致非同源和同源定向 DNA DSB 修复途径受阻。通过删除 NPM1 亚细胞定位信号，我们发现 PR 会结合 NPM1，无论 NPM1 指向哪个细胞区室。删除已知可与其他富含精氨酸的蛋白质结合的 NPM1 酸性环基序可消除 PR 和 NPM1 结合。使用共聚焦和超分辨率免疫荧光显微镜，我们发现 RAD52（SSA 修复机制的一个组成部分）的水平相对于使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑删除了 C9ORF72 扩增的同源对照显著增加 iPSC 神经元。对死后脑组织的 Western 分析证实，与对照相比，C9ALS/FTD 样本中的 RAD52 免疫反应性显著增加。
当前提高 CRISPR 敲入效率的策略
摘要：自 2012 年发现以来，成簇的规律间隔短回文重复序列 (CRISPR) 和 CRISPR 相关蛋白 9 (Cas9) 系统为开发新型、高精度的基于基因组编辑的基因治疗 (GT) 替代方案提供了广阔的前景，从而克服了与经典 GT 相关的挑战。经典 GT 旨在通过慢病毒 (LV) 或腺相关病毒 (AAV) 将转基因随机整合到基因组中或以游离形式持续进入细胞核，从而将转基因递送到细胞中。尽管使用 LV 或 AAV 可以实现高转基因表达效率，但它们的性质可能会对人类产生严重的副作用。例如，基于 LV（NCT03852498）和 AAV9（NCT05514249）的 GT 临床试验分别表明，用于治疗 X 连锁肾上腺脑白质营养不良症和杜氏肌营养不良症的 GT 出现了骨髓增生异常综合征和患者死亡。与经典 GT 相比，基于 CRISPR/Cas9 的基因组编辑需要细胞的同源直接修复 (HDR) 机制才能将转基因插入基因组的特定区域。这种复杂且受良好调控的过程在哺乳动物细胞的细胞周期中受到限制，而非同源末端连接 (NHEJ) 则占主导地位。因此，寻找提高 HDR 效率的方法，使其优于 NHEJ，至关重要。本文全面回顾了当前用于改进基于 CRISPR/Cas9 的 GT 的 HDR 的替代方案。