在人DNA中,有4-6%的胞嘧啶是甲基化的,其中60-90%的甲基化胞嘧啶在CpG位点(1,2)。相比之下,微生物物种中CpG位点的甲基化很少见。NEBNEXT微生物组DNA富集试剂盒使用一种简单而快速的基于磁珠的方法来选择性结合和去除CpG-甲基化的宿主DNA。该方法使用MBD2-FC蛋白,该蛋白由甲基化的CpG特异性结合蛋白MBD2组成,该蛋白与人IgG的FC片段融合在一起。FC片段很容易与蛋白A结合,从而有效地附着在蛋白A结合的磁珠上。该蛋白质的MBD2结构域特异性结合与CpG甲基化DNA。磁场的应用然后拔出CpG-甲基化(真核)DNA,将非CPG-甲基化(微生物)DNA留在上清液中(3)。如果需要,可以洗脱在磁性珠粒中捕获的宿主DNA,并为此提供协议。
NEBNext UltraExpress DNA 文库制备试剂盒包含所需的酶和缓冲液,可将 10-200 ng DNA 快速转化为高质量文库,以便在 Illumina 平台上进行测序。快速、简单的工作流程减少了清理步骤,最大程度地缩短了手动操作时间,并允许在整个输入范围内使用单一接头稀释度和 PCR 循环条件。该方案还允许在单个试管中制备文库,从而最大限度地减少塑料耗材浪费。除了标准方案外,还包含一个附录,其中详细介绍了针对不同 DNA 输入量的定制接头和循环建议,如果需要进一步优化文库产量。
库由(a)10 ng和(b)200 ng的人gdna(Na19240)用6个PCR循环稀释为1:3,并在挂接的HSD1000屏幕截图上运行。图4.1.b显示了在晚期PCR周期下200 ng样品的非线性扩增阶段导致的上部标记上方的峰(由红色箭头指示)。尽管在非线性扩增阶段产生的分子是可行的,但它们在屏幕映射上的迁移速度的不同迁移速度会导致文库浓度的定量不准确。在这种情况下,我们建议使用400 bp或预期的库大小来测量纳米体或疯子上的库浓度,以将浓度值转换为纳米尔。以下方程可用于将浓度从ng/μl转换为nm:[(ng/μl中的库浓度)/(bp中的660 g/mol x库尺寸)] x 10 6 = nm中的浓度。
功能活性(粘性终端连接):20μl含有0.5 µL快速T4 DNA连接酶,12μgHindiii消化的lambda DNA和1x T4 DNA连接酶在37°C下孵育37°C,过夜,由Agarose gelorophoresis确定的片段,在> 95%的片段中,> 95%的片段。重新消化的连接产物,50μl反应,其中含有6μg连接的片段,40个单位Hindiii和1x的Nebuffer 2在37°C下孵育2小时,导致未检测到的未检测到的未发现的片段,因为琼脂糖凝胶电基果实确定。
应用Illumina的Nebnext Ulta DNA库准备套件包含酶和缓冲液,是将少量DNA输入转换为Illumina Platform(Illumina,Inc)上下一代测序的索引库的理想选择。Nebnext Ultra DNA库的工作流程的Illumina的Prep套件非常友好且快速,动手的时间很少。这些组件中的每一个都必须通过严格的质量控制标准,并且无论是单独还是作为一组试剂。
该产品仅用于研究目的。该产品不打算用于人类或动物的治疗或诊断目的。产品和内容由新英格兰Biolabs,Inc(NEB)拥有或控制的一项或多项专利,商标和/或版权。商标符号的使用并不一定表明该名称在正在阅读的国家 /地区都有商标;它指示了最初开发内容的地方。请参阅www.neb.com/trademarks。使用这些产品可能要求您获得某些应用程序的其他第三方知识产权。有关更多信息,请发送电子邮件至busdev@neb.com。该产品已获得美国PAT下的Bio-Rad Laboratories,Inc。的研究和商业用途。nos。6,627,424,7,541,170,7,670,808,7,666,645,以及其他国家 /地区的相应专利。除下一代测序工作流程中的量化外,没有授予将产品用于数字PCR或实时PCR应用程序的权利。
某些物质需要经过认证的处理人员。这包括需要管制物质许可证的物质、大多数爆炸物、脊椎动物毒剂和某些熏蒸剂。属于第 1 类或第 2 类的急性毒性物质(例如杀虫剂)也需要经过认证的处理人员。请参阅《2015 年工作健康与安全法》了解更多信息 某些高度危险物质需要跟踪。这些物质需要由经过适当培训的人员控制或适当保护。请参阅《2015 年工作健康与安全法》了解更多信息 持有某些爆炸物、脊椎动物毒剂和熏蒸剂需要管制物质许可证。有关更多信息,请参阅《2017 年工作健康与安全条例》第 7 部分
某些物质需要经过认证的处理人员。这包括需要管制物质许可证的物质、大多数爆炸物、脊椎动物毒剂和某些熏蒸剂。属于第 1 类或第 2 类的急性毒性物质(例如杀虫剂)也需要经过认证的处理人员。请参阅《2015 年工作健康与安全法》了解更多信息 某些高度危险物质需要跟踪。这些物质需要由经过适当培训的人员控制或适当保护。请参阅《2015 年工作健康与安全法》了解更多信息 持有某些爆炸物、脊椎动物毒剂和熏蒸剂需要管制物质许可证。有关更多信息,请参阅《2017 年工作健康与安全条例》第 7 部分
注意:此处提供的Spriselect或Nebnext样品纯化珠的体积可与此步骤中的精确缓冲液中包含的样品一起使用(71.5 µL;步骤1.2.5。)。也可以使用Ampure XP珠。如果使用Ampure XP珠,请在使用前至少30分钟将珠子温暖至室温。这些珠子量可能无法正常工作以在工作流程的不同步骤中进行清理,或者在此步骤中是第二个清理。对于在不同缓冲条件下包含的样品的清理,可能需要实验确定体积。
6 将 100 μl 或 200 μl 移液器调至 80 μl,然后上下移取整个体积至少 10 次以充分混合。快速旋转以收集管壁上的所有液体 注意:NEBNext Ultra II Ligation Master Mix 粘稠。应注意确保充分混合连接反应,因为混合不完全会导致连接效率降低。少量气泡的存在不会影响性能。