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使用工程化的 CRISPR RNA 引导胞苷脱氨酶对结核分枝杆菌进行可编程碱基编辑
耐多药结核分枝杆菌 ( Mtb ) 感染严重危害全球人类健康，迫切需要新的治疗策略。高效的基因组编辑工具有助于识别参与细菌生理、发病机制和耐药机制的关键基因和途径，从而有助于开发耐药结核病的新疗法。在这里，我们报告了一个双质粒系统 MtbCBE，用于灭活基因并在 Mtb 中引入点突变。在该系统中，辅助质粒 pRecX-NucS E107A 表达 RecX 和 NucS E107A 以抑制 RecA 依赖性和 NucS 依赖性的 DNA 修复系统，碱基编辑质粒 pCBE 表达结合胞苷脱氨酶 APOBEC1、Cas9 切口酶 (nCas9) 和尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂 (UGI) 的融合蛋白。这两个质粒共同实现了结核分枝杆菌基因组中所需位点处 G:C 到 A:T 碱基对的有效转换。碱基编辑系统的成功开发将有助于阐明结核分枝杆菌致病机理和耐药性的分子机制，并为开发其他微生物的碱基编辑工具提供重要启发。
利用DSB维修以促进有效的同源性...
Prime编辑最近作为用于精确基因组编辑的下一代方法。在这里，我们利用DNA双链断裂（DSB）修复来开发两种新型策略，这些策略使用基于SP Cas9核酸酶的Prime Editor（PEN）安装精确的基因组插入。我们首先证明，与常规的Prime编辑指南RNA（PEGRNA）相连，可以有效地通过依赖同源性的DSB修复机制促进短基因组插入。虽然笔编辑导致副产品的水平增加，但它挽救了与基于Nickase的Prime编辑器表现不佳的Pegrnas。我们还提出了一种小分子方法，该方法产生了笔编辑的产物纯度。接下来，我们通过设计一个单个启动插入GRNA（springRNA）来开发同源性独立笔编辑策略，该插入式插入式插入（SpringRNA）通过非同源端连接途径（NHEJ）安装DSB的基因组插入。最后，我们表明，在DSB上进行的笔介导的插入阻止了Cas9诱导的大染色体缺失，并提供了证据表明连续CAS9介导的切割是Cas9诱导的大缺失的一种机制之一。总的来说，这项工作通过利用包括NHEJ在内的不同的DNA修复机制来扩展当前的Prime编辑工具箱，NHEJ代表了哺乳动物细胞中DSB修复的主要途径。
配对的划分介导的COL17A1重新构图用于连接表皮细胞Bullosa
连接表皮溶解Bullosa（JEB）是一种令人衰弱的遗传性皮肤疾病，由编码Lam-Inin-332，XVII型胶原蛋白（C17）的基因突变引起，并综合素6 B 4，维持模糊和表皮之间的稳定性。我们签署了患者特异性的cas9-核酸酶和基于 - 基因酶的靶向策略，用于在Col17a1的外显子52中重新构建与缺乏全长C17表达相关的共同纯合子deportion。随后对蛋白质的重新修复，糖节组成以及治疗后的DNA和mRNA结局的发散表明，基于成对的基于成对的COL17A1编辑的吉利效率，安全性，安全性和精度。几乎46％的原发性jeb角细胞表达了C17。重新构架Col17a1 tran-文字主要具有25和37-nt的缺失，占所有编辑的> 42％，编码C17蛋白质变体，可准确地定位于细胞膜。此外，与未处理的JEB细胞相比，经过校正的细胞显示出精确的细胞外120 kDa C17结构域的精确脱落，并提高了对层粘连蛋白332的粘附能力。三维（3D）皮肤等效物在表皮和真皮之间的基底膜区域内表现出C17的认可和连续沉积。我们的发现构成了第一次基于基因编辑的Col17a1突变的校正，并证明了基于Cas9 D10A Nickase比野生型CAS9 Cas9基于野生型Cas9策略在临床环境中基于基因重塑的Prox-Imal配对迹象策略的优越性。
LGMDR21 iPSC 的疾病建模和基因校正阐明了 POGLUT1 在骨骼肌维持、再生和卫星细胞微环境中所起的作用
常染色体隐性肢带型肌营养不良症 21 (LGMDR21) 是由蛋白质 O-葡萄糖基转移酶 1 (POGLUT1) 的致病变异引起的，该酶负责对 50 种哺乳动物蛋白质（包括 Notch 受体）中发现的特定表皮生长因子 (EGF) 重复序列进行 O-糖基化。先前的患者活检数据表明，Notch 信号传导受损、肌肉干细胞减少和分化加速可能与疾病病因有关。使用患者诱导的多能干细胞 (iPSC)、其校正同种型和对照 iPSC，基因表达谱分析表明 POGLUT1、NOTCH、肌肉发育、细胞外基质 (ECM)、细胞粘附和迁移的失调是相关通路。它们还表现出体外 POGLUT1 酶活性和 NOTCH 信号传导降低以及肌肉生成、增殖、迁移和分化缺陷。此外，体内研究表明植入、肌肉干细胞形成、PAX7 表达和维持显著减少，同时间质中错误定位的 PAX7 + 细胞百分比增加。使用 CRISPR-Cas9 切口酶对患者 iPSC 进行基因校正可挽救主要的体外和体内表型。这些结果证明了 iPSC 和基因校正在疾病建模和表型挽救中的功效，并提供了肌肉干细胞生态位定位、PAX7 表达和细胞迁移作为 LGMDR21 的可能机制参与的证据。
使用改进的Prime编辑系统
CRISPR/CAS介导的基因组编辑技术已被广泛应用于通过在各种植物物种中产生短插入或缺失（Indel）来创建基因的基因淘汰等位基因。由于同源指导修复（HDR）的低效率和HDR DNA模板的差异，精确的基因组编辑在植物中仍然具有挑战性（Mao等，2019）。最近开发了一种串联重复HDR方法，用于替换水稻的序列，这对单子叶植物最有用（Lu等，2020）。基础编辑器从Cas9 nickase融合与胞嘧啶和腺嘌呤脱氨酶相关的基础编辑器实现了目标的C-T或A-TO-G替换，但仅限于特定类型的碱基替代品和目标位点选择（Mao等人，2019年）。在哺乳动物细胞中开发了一种“搜索和替换”方法，也称为Prime编辑，该方法可以在目标位点上的用户定义的序列变化而无需DSB或DNA修复模板提供（Anzalone等，2019）。几个研究小组已经采用了这种方法用于单子叶植物，包括大米和小麦（Butt等，2020; Hua等，2020; Li等，2020; Lin等，2020; Tang等，2020; 2020; Xu等，2020）。由于尚不清楚的原因，尽管基础编辑在诸如大米之类的单子叶植物中非常有效，但其dicot中的效率在dicots中非常低（Kang等，2018; Mao等，2019）。尚不清楚是否可以将主要编辑用于番茄植物（例如番茄）。在这里，我们报告了通过密码子和发起人优化在番茄中成功采用的主要编辑者。
PNB设计师：设计用于动物和植物的Prime和Base Editor指南的Web应用程序
抽象背景：CRISPR工具箱通过标记效应子域的快速扩展，以酶促无效CAS9（DCAS9）或Cas9 Nickase（NCAS9）导致了几种有希望的新基因编辑策略。最近的添加包括CRISPR胞嘧啶或腺嘌呤碱基编辑器（CBES和ABES）和CRISPR Prime编辑器（PES），其中脱氨酶或逆转录酶分别融合到NCAS9。这些工具在动物和植物模型中建模并纠正引起疾病的突变的巨大希望。但到目前为止，还没有广泛可用的工具可以自动化BE和PE试剂的设计。结果：我们开发了PNB Designer，这是一种基于Web的PEGR NAS设计的应用程序，用于BES，并指导RNA。PNB设计师使设计定位指向RNA的指南RNA针对跨越多个王国的变体或参考基因组上的单个或多个靶标的指南RNA。与PNB设计师一起，我们设计了PegrNA，以模拟所有已知疾病，从而导致Clinvar可用的突变。此外，PNB设计人员可用于设计指南RNA来安装或恢复SNV，用一个CBE和七个不同的ABE PAM变体扫描基因组，并返回最佳使用。PNB设计师可以在http：//fgcz-shiny .uzh.ch.ch.ch/pnbde signe r/结论上公开访问：结论：使用PNB设计师，我们为CRISPR PE和BE Reagents创建了一种用户友好的设计工具，应该简化选择编辑策略和避免设计并避免设计并进行设计。
EGFR基因编辑通过CRISPR/CAS9和PRIME编辑EGFR基因编辑通过CRISPR/CAS9和PRIME编辑
将CRISPR/CAS9系统作为基因编辑工具的功能彻底改变了该领域，这是由于其易于设计和高灵敏度。CRISPR/CAS9系统有效地规避了先前基因编辑工具的局限性，并为基因组编辑的新时代铺平了道路。但是，更多的研究指出了CRISPR/CAS9自身的局限性。该技术的主要缺陷之一是脱靶效应的频率相对较高。为了克服这些障碍，最近已经开发了一种称为Prime Editing（PE）的第四代基因编辑工具。Prime编辑具有三个组成部分：Cas9 nickase，逆转录酶和Prime Editing Guide RNA（Pegrna）。PEGRNA可以进一步分解为间隔序列，支架，底漆结合位点和逆转录（RT）模板。RT模板已经包括可以通过逆转录酶转录的所需序列。这种新合成的DNA取代了原始链，提供了非常精确的编辑，而不是CRISPR/CAS9系统产生的随机插入/删除敲除。为此，我们进行了一系列研究，以比较CRISPR/CAS9系统和主要编辑的编辑效率。由CRISPR/CAS9系统敲除靶基因EGFR，已通过T7E1测定和质粒报告系统验证，这是强烈的绿色荧光信号所证明的。下一代测序已量化了Prime编辑的编辑率以及CRISPR/CAS9的编辑速率。ngs数据显示CRISPR/CAS9系统的高编辑频率，而未检测到Prime编辑的编辑。这种结果的可能原因之一是缺乏高通量实验来优化EGFR基因特异性的PEGRNA成分。
非双重遗传病的基因组编辑......
《自然》杂志上发表的一篇文章（ Anzalone 等人，2019 年）报道了一种基因组编辑实验方法的开发，该方法无需双链断裂 (DSB) 或供体 DNA (dDNA) 模板，即可介导人类基因组中所有可能的碱基到碱基的转换、“插入/缺失”和组合。Prime 编辑是一种新颖的基因组编辑方法，它利用一种比平常更长的单向导 RNA (gRNA)，称为 Prime 编辑 gRNA (pegRNA)，以及一种由 Cas9 H840A 切口酶与工程逆转录酶 (RT) 融合而成的融合蛋白。Prime 编辑被描述为“搜索和替换”碱基编辑技术，它在 gRNA 的延伸中提供所需的遗传构建体，然后使用 RT 酶将其转化为 DNA。与传统的 CRISPR-Cas 设备相比，新方法无需同时递送校正 DNA 模板，可执行所有可能的核苷酸替换（包括针对相当一部分遗传疾病的替换），解决插入/缺失引起的移码问题，并减少脱靶编辑。Prime 编辑是对现有 CRISPR 编辑系统的一个令人兴奋的新补充，在许多情况下甚至可能是一种改进。然而，Prime 编辑带来了新的挑战。克服这些障碍并在体内应用 Prime 编辑，将带来针对罕见遗传疾病的新型基因组编辑疗法。
人工智能生成的小活页夹改进了主要编辑
引物编辑 2 (PE2) 系统包含一个切口酶 Cas9，该切口酶与逆转录酶融合，利用引物编辑向导 RNA (pegRNA) 在目标基因组位点引入所需突变。然而，PE 效率受到错配修复 (MMR) 的限制，错配修复会切除包含所需编辑的 DNA 链。因此，通过显性负 MLH1 (MLH1dn) 的瞬时表达抑制 MMR 复合物的关键成分，PE 效率比 PE2 提高约 7.7 倍，从而生成 PE4。在此，通过利用生成人工智能 (AI) 技术 RFdiffusion 和 AlphaFold 3，我们最终生成了一种从头 MLH1 小结合物（称为 MLH1-SB），它与 MLH1 和 PMS2 的二聚体界面结合，以破坏关键 MMR 成分的形成。MLH1-SB 的尺寸很小（82 个氨基酸），因此可以通过 2A 系统将其整合到预先存在的 PE 架构中，从而创建一个新颖的 PE-SB 平台。结果，通过将 MLH1-SB 整合到 PE7 中，我们开发了一种改进的 PE 架构，称为 PE7-SB，它表现出迄今为止最高的 PE 效率（在 HeLa 细胞中是 PE2 的 29.4 倍，是 PE7 的 2.4 倍），这表明生成式 AI 技术将促进基因组编辑工具的改进。
利用 prime 编辑系统高效生成小鼠模型
亲爱的编辑，人类的大多数遗传疾病是由单核苷酸突变引起的。尽管使用基于 CRISPR 的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 1 或腺嘌呤碱基编辑器 (ABE) 2 进行基因组编辑对于某些遗传疾病中 C 到 T 和 A 到 G 碱基替换的基因校正大有希望 3,4，但这两种编辑器对于纠正其他变异（如碱基颠换、小插入和缺失 (indel)）均无效。prime editing 系统是一种“搜索和替换”基因组编辑技术，最近被添加到基因组编辑工具包 5 中。prime editors (PEs) 结合了外源性 CRISPR/Cas9 系统和内源性 DNA 修复系统，以实现更大的编辑多功能性，诱导 CBE 和 ABE（C → T、G → A、A → G 和 T → C）之外的所有类型的碱基到碱基转换、小插入/缺失及其组合。基因组编辑系统从PE1进化到PE3（PE3b），效率逐步提高5。PE1的执行器由工程化的Cas9切口酶与逆转录酶（M-MLV RTase）5融合构建，可靶向基因组位点，切口DNA并引发逆转录（RT）。执行器结合工程化的基因组编辑向导RNA（pegRNA）寻找并切口目标DNA，从而通过RT将新的遗传信息编码到基因组中。然后，对M-MLV RTase引入突变以提高PE1的编辑效率，此PE2被称为PE2。随后，在PE3b中，执行器与工程化的Cas9切口酶5融合，可靶向基因组位点，切口DNA并引发逆转录（RT）。执行器与工程化的基因组编辑向导RNA（pegRNA）结合，寻找并切口目标DNA，从而通过RT将新的遗传信息编码到基因组中。然后，对M-MLV RTase引入突变以提高PE1的编辑效率，此PE2被称为PE2。