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首次通过核糖核蛋白（RNP ...
摘要：Castanea sativa是全球重要的树坚果物种，以其多功能作用，尤其是木材和坚果生产而受到高度赞赏。如今，需要采取新的策略来实现对疾病，气候变化，更高产量和营养质量的植物弹性。 在新的植物育种技术（NPBT）中，CRISPR/CAS9系统代表了在短时间内改善植物育种的强大工具。 此外，CRISPR/CAS9构建体可以以核糖核蛋白（RNP）的形式传递到细胞中，从而避免通过原生质体技术避免外源DNA（无GMO-FRO）整合，这代表了基因编辑的有趣材料，这要归功于高度渗透性的DNA膜。 在本研究中，我们开发了从欧洲栗子体细胞胚胎开始的第一个原生质体隔离方案。 针对细胞壁消化优化的酶溶液含有1％纤维素酶Onozuka R-10和0.5％MacRozyme R-10。 在黑暗条件下在25℃孵育4小时后，获得了4,500,000个原生质体/mL的产率（可行的91％）。 使用GFP标记基因评估转染能力，转染原生质体的百分比为51％，在转染事件后72小时。 然后对靶向植物去饱和酶基因的直接递送进行了纯化的RNP。 结果揭示了CRISPR/CAS9 RNP和有效的原生质体编辑的预期目标修饰。如今，需要采取新的策略来实现对疾病，气候变化，更高产量和营养质量的植物弹性。在新的植物育种技术（NPBT）中，CRISPR/CAS9系统代表了在短时间内改善植物育种的强大工具。此外，CRISPR/CAS9构建体可以以核糖核蛋白（RNP）的形式传递到细胞中，从而避免通过原生质体技术避免外源DNA（无GMO-FRO）整合，这代表了基因编辑的有趣材料，这要归功于高度渗透性的DNA膜。在本研究中，我们开发了从欧洲栗子体细胞胚胎开始的第一个原生质体隔离方案。针对细胞壁消化优化的酶溶液含有1％纤维素酶Onozuka R-10和0.5％MacRozyme R-10。在黑暗条件下在25℃孵育4小时后，获得了4,500,000个原生质体/mL的产率（可行的91％）。使用GFP标记基因评估转染能力，转染原生质体的百分比为51％，在转染事件后72小时。然后对靶向植物去饱和酶基因的直接递送进行了纯化的RNP。结果揭示了CRISPR/CAS9 RNP和有效的原生质体编辑的预期目标修饰。
拓扑复杂的 RNP 底物中的序列引导 RNA 重塑
摘要：DEAD-box ATPase 是 RNA 生物学各个方面必不可少的普遍存在的酶。然而，这些酶有限的体外催化活性与它们复杂的细胞作用不一致，最显著的是它们在核糖核蛋白 (RNP) 组装过程中驱动大规模 RNA 重塑步骤。我们描述了 60S 核糖体生物合成中间体的低温电子显微镜结构，揭示了 DEAD-box ATPase Spb4 的上下文特异性 RNA 解旋如何导致 rRNA 二级结构的广泛、序列定向重塑。多个顺式和反式相互作用稳定了催化后高能中间体，从而驱动 rRNA 结构域 IV 内根螺旋结构的组织。该机制解释了如何利用 DEAD-box ATPase 有限的链分离来提供非平衡方向性并确保高效准确的 RNP 组装。
配方条件对脂质纳米颗粒特性和 CRISPR RNP 基因敲除和校正功能传递的影响
摘要：CRISPR-Cas9 系统是一种新兴的治疗工具，具有纠正多种遗传疾病的潜力。然而，对于基因治疗应用，需要一种有效的运载工具，能够将 CRISPR-Cas9 成分运送到目标细胞群的细胞溶胶中。在本研究中，我们优化了脂质纳米颗粒 (LNP) 的配方条件，以运送现成的 CRISPR-Cas9 核糖核酸蛋白 (RNP)。复合过程中的缓冲液组成和相对 DOTAP 浓度因 LNP 封装内部生产的 Cas9 RNP 或 Cas9 RNP 与用于基因校正的额外模板 DNA 而不同。通过不对称流场流分馏 (AF4) 对 LNP 的尺寸、表面电荷和等离子体相互作用进行了表征。在荧光报告细胞系上对粒子进行了功能筛选，以进行基因敲除和基因校正。这揭示了 RNP 与柠檬酸盐缓冲液和 PBS 的不相容性。我们证明了用于基因敲除的 LNP 不一定需要 DOTAP，而用于基因校正的 LNP 仅在低浓度的 DOTAP 下才有效。AF4 研究还表明 LNP 与血浆相互作用，但保持稳定，而 HDR 模板似乎有利于 LNP 的稳定性。在最佳配方条件下，我们在纳摩尔浓度的 CRISPR-Cas9 RNP 下分别实现了高达 80% 和 20% 的基因敲除和基因校正效率。
EDIT-301 的临床前开发，这是一种自体细胞疗法，由 AsCas12a-RNP 修饰的动员外周血 CD34 + 细胞组成，用于治疗潜能
致谢：本研究由 Editas Medicine 资助。作者要感谢所有 Editas 同事帮助规划、执行、分析和展示本研究，并感谢加州大学旧金山分校的 Mark Walters 博士慷慨提供 TDT CD34 + 细胞。编辑协助由 2 the Nth（英国柴郡）的 Anna Marshall（理学学士，荣誉）提供，由 Editas Medicine 资助。
细胞内递送 CRISPR-Cas9 RNP 以用于医疗应用
• 可以进行DNA编辑的工具 • 由Cas9蛋白和gRNA组成 • gRNA识别并切割目标序列。 • 切割的序列主要通过末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）进行修复 • NHEJ容易发生缺失和突变等错误→适用于基因缺失 • HDR可以根据供体DNA的设计引入所需的序列。
由离子交换色谱法对CRISPR RNP的表征
•我们在这里描述了一个离子 - 交换色谱分析方法的发展和拟合用途的资格，以帮助表征RNP络合•无复合蛋白的数量达到了不同的高原，单域与Dimeric apoer apoer apo-grnas在GRNA上：CAS率≥1•理解这些非元件的核对范围的关系，是键入的核对范围的关系，是纽约的核对范围的关系。化合物作为治疗学
CRISPR/RNPS- ...
结果：这项研究表明，土壤生长的叶子或愈伤组织衍生的胡椒原生质体是筛选有效的CRISPR/CAS9或CRISPR/CAS12A（CPF1）的有效指南RNA的有用系统。crispr/cas9或cpf1作为纯化的内切核酸酶的CRISPR/RNP复合物与设计的单个指南RNA混合在一起，可以编辑靶基因，camlo2，camlo2，在两个辣椒品种中，具有整个基因组测序，capsicum nuuum nuuum'cm334'和C. annuum'和annuum'dempsey'。在CM334和Dempsey和dempsey和Cleave Camlo2的体外，设计的Guide RNA（Cas9或CRRNA的SGRNA或CRRNA）在Camlo2中保守。crispr /cas9-或 /cpf1-RNP复合物被转染到热胡椒cm334的纯粹分离的原生质体中，并通过PEG介导的递送转染了甜辣椒dempsey。有针对性的深层测序分析表明，根据应用的CRISPR/RNP，在两个品种中都差异地编辑了靶向的Camlo2基因。
![基于所需导航性能 (EoR) (RNP) 概念验证和实施计划：人为因素差距分析 [第 1 阶段最终报告]](/simg/d/db27fc2e7e22fa4001b25110d1c7801e3c0e5070.webp)
基于所需导航性能 (EoR) (RNP) 概念验证和实施计划：人为因素差距分析 [第 1 阶段最终报告]
15. 补充说明 本研究由美国联邦航空管理局的下一代人为因素部门资助，合同编号为 DTFAWA-15-D-00025，TORFP 5092，建立在所需导航性能人为因素实施指导支持的基础上。Architecture Technology Corporation 分包给 Evans Incorporated，以提供空中交通管制运行人为因素方面的研究专业知识。据信，这项研究代表了对美国空中交通管制中使用 RNP-AR 方法相关的运行人为因素的首次调查之一；之前在基于性能的导航领域的人为因素研究主要针对驾驶舱的人为因素。本研究分两个阶段进行：第一阶段是分析 EoR 运行中的人为因素考虑因素，而第二阶段涉及实施指导材料的开发。本报告是与该项目相关的两份报告中的第一份，提供了第一阶段的结果。本报告对合同交付物进行了轻微修改，以提高可访问性。 16. 摘要 美国联邦航空管理局 (FAA) NextGen 人为因素部门委托开展这项研究，以确定和分享从两个空中交通管制机构获得的经验教训，这两个机构是“早期采用”基于要求的导航性能 (EoR) (RNP) 程序的机构。西雅图-塔科马国际机场和丹佛国际机场
基于所需导航性能 (EoR) (RNP)
第一阶段最终报告 14. 资助机构代码 ANG-C1 15. 补充说明 本研究由美国联邦航空管理局下一代人为因素部资助，合同号为 DTFAWA-15-D-00025、TORFP 5092，建立在所需导航性能人为因素实施指导支持的基础上。Architecture Technology Corporation 分包给 Evans Incorporated，以提供空中交通管制运行中人为因素的研究专业知识。据信，本研究是美国首次对与美国空中交通管制中使用 RNP-AR 方法相关的运行人为因素进行调查的研究之一；此前在基于性能导航领域的人为因素研究主要涉及驾驶舱中的人为因素。本研究分两个阶段进行：第一阶段分析 EoR 运行中的人为因素考虑因素，第二阶段则涉及实施指导材料的制定。本报告是与该项目相关的两份报告中的第一份，提供了第一阶段的结果。本报告对合同交付物进行了轻微修改，以提高可访问性。16. 摘要 美国联邦航空管理局 (FAA) NextGen 人为因素部门委托进行这项研究，以确定和分享从两个空中交通管制设施中吸取的经验教训，这两个设施是“早期采用”基于要求的导航性能 (EoR) (RNP) 程序的机构。西雅图-塔科马国际机场和丹佛国际机场是美国国家空域系统 (NAS) 内最先实施 EoR 的两个机场。研究的第一阶段涉及审查相关概念验证文档和研究文献。随后对西雅图和丹佛终端雷达管制 (TRACON) 设施的人员进行了 38 次采访，其中包括 24 名认证专业管制员。结果包括考虑空中交通管制员如何将新程序融入他们在相关运营（西雅图）和间隔较大的运营（丹佛）中的控制风格和实践中。本报告还讨论了一些支持或阻碍管制员使用新程序的组织和运营因素。研究结果可能有助于实现其他机场 EoR 的潜在优势，也可用于支持在国家空域系统内更广泛地实施基于轨迹的运营。这项研究还为在空中交通管制中引入新技术、新程序和自动化提供了一些人为因素和变革管理见解。 17. 关键词 18. 分布说明 人为因素；空中交通管制；基于所需导航性能 (EoR) (RNP)；所需导航性能：需要授权 (RNP-AR)；程序；基于性能的导航 (PBN)；基于轨迹的运营 (TBO)，自动化。
