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金电沉积中铊测定的新型分析方法 Patrick Saitta、Jingjing Wang 和 Eugene Shalyt KLA-Tencor 60 Gordon
摘要 铊在氰化物和亚硫酸盐镀金溶液中都用作添加剂，用于调节金在目标基材上的沉积方式。镀液中的铊含量对沉积金的性质（包括其微观结构和硬度）有很大影响。因此，特别是在商业工艺应用中，准确、快速、方便地测量镀液中的铊含量至关重要，以确保所制造产品的质量。人们已经研究了含铊的镀金溶液的循环伏安行为，但其铊含量的量化并不令人满意，要么昂贵且耗时，要么在复合基质中不准确。在这里，我们提出了一种专有的电分析铊测量方法，该方法快速且具有出色的准确性和灵敏度，即使在存在常见的镀液分解产物的情况下也是如此。关键词 循环伏安法、电化学沉积、镀金溶液、铊、亚硫酸盐镀液。
定量的活细胞成像和计算建模为内源WNT/CTNNB1信号动力学
摘要Wnt/CTNNB1信号传导调节所有多细胞动物的组织发育和稳态，但是潜在的分子机制仍未完全理解。具体而言，缺少对内源性蛋白质行为的定量见解。在这里，我们结合了CRISPR/CAS9介导的基因组编辑和定量活细胞显微镜，以测量在生理和致癌条件下人类细胞中荧光标记，内源性CTNNB1的动力学，扩散特征和绝对浓度。最先进的成像表明，与途径的激活状态无关，CTNNB1的大量CTNNB1驻留在缓慢的细胞质复合物中。当Wnt/ctnnb1被激活时，这种细胞质CTNNB1复合物的大小会大大降低。基于我们的生物物理测量结果，我们构建了WNT/CTNNB1信号传导的计算模型。我们的综合实验和计算方法表明，Wnt途径激活通过三个调节节点调节不同亚细胞隔室的游离和复杂的CTNNB1的动态分布：破坏性复合物，核细胞质式穿梭和核定率。
用于序列特异性的抗间隔肽核酸……
尽管基于 CRISPR-Cas9 的技术得到了快速而广泛的应用，但用于调节剂量、时间和精度的便捷工具仍然有限。基于使用合成肽核酸 (PNA) 以异常高的亲和力结合 RNA 的方法，我们描述了向导 RNA (gRNA) 间隔区靶向或“反间隔区”PNA，作为以序列特异性方式调节细胞中 Cas9 结合和活性的工具。我们证明 PNA 可以快速有效地以低剂量靶向复合 gRNA 间隔区序列，并且不受序列选择性 Cas9 抑制的设计限制。我们进一步表明，短 PAM 近端反间隔区 PNA 可实现有效的切割抑制（减少超过 2000 倍），并且 PAM 远端 PNA 可改变 gRNA 亲和力以促进靶向特异性。最后，我们应用反间隔物 PNA 来对两个 dCas9 融合系统进行时间调控。这些结果提出了一种新颖的合理核蛋白工程方法，并描述了一种可快速实施的 CRISPR-Cas9 调节反义平台，以提高应用的时空多功能性和安全性。
第8章
从本工作中出现的复式tRNA基因的广泛合成的原理如下。DNA双链体将被变性为形成单链。将在有两个适当的引物的足够大过量的情况下执行此变性步骤。冷却后，一个人希望获得两个结构，每个结构包含与底漆适当复杂的模板链的全长。DNA聚合酶以完成修复复制过程。应导致原始双链体的两个分子。可以重复整个周期，每次新剂量的酶都会添加。但是，在DNA双链体变性后冷却后，形成原始双链体的恢复性会占主导地位，而不是模板 - 播种机复合物的形成。如果无法通过调整底漆的浓度来规避这种趋势，显然，将不得不诉诸于链的分离，然后进行修复复制。在每个修复复制周期之后，必须重复链分离的过程。基于这些思维方式的实验正在进行中。
通过脂质纳米颗粒递送稳定的 CRISPR–Cas9 核糖核蛋白对肺和肝脏进行编辑
如果能够可靠地生产有效的 RNP-LNP 复合物，则脂质纳米颗粒 (LNP) 递送成簇的规律间隔的短回文重复 (CRISPR) 核糖核蛋白 (RNP) 可以实现高效、低毒和可扩展的体内基因组编辑。在这里，我们从嗜热地芽孢杆菌 (GeoCas9) 中设计了一种耐热的 Cas9，以生成 iGeoCas9 变体，与天然 GeoCas9 酶相比，该变体能够对细胞和器官进行 100 倍以上的基因组编辑。此外，iGeoCas9 RNP-LNP 复合物可编辑多种细胞类型，并在接受共同递送的单链 DNA 模板的细胞中诱导同源性定向修复。使用组织选择性 LNP 制剂，我们观察到在接受单次静脉注射 iGeoCas9 RNP-LNP 的报告小鼠的肝脏和肺中基因组编辑水平为 16 œ 37%。此外，与可生物降解的 LNP 复合的 iGeoCas9 RNP 可以编辑肺组织中致病的 SFTPC 基因，平均效率为 19%，这比之前使用病毒或非病毒递送策略观察到的基因组编辑水平有了很大的提高。这些结果表明，热稳定性 Cas9 RNP-LNP 复合物可以扩大基因组编辑的治疗潜力。
利用脂质纳米颗粒在子宫内将 mRNA 递送至心脏、横膈膜和肌肉
基于纳米颗粒的药物输送系统有可能彻底改变医学，但其低血管通透性和被吞噬细胞快速清除的特性限制了其在医学上的影响。由于胎儿组织中血管生成和细胞分裂率高以及免疫系统尚未发育完全，在子宫内输送纳米颗粒可以克服这些关键限制。然而，人们对胎儿发育阶段的纳米颗粒药物输送知之甚少。在本报告中，我们使用 Ai9 CRE 报告小鼠证明脂质纳米颗粒 (LNP) mRNA 复合物可以在子宫内输送 mRNA，并且可以进入和转染主要器官，例如心脏、肝脏、肾脏、肺和胃肠道，效率高且毒性低。此外，在出生后 4 周，我们证实横膈膜、心脏和骨骼肌中分别有 50.99 ± 5.05%、36.62 ± 3.42% 和 23.7 ± 3.21% 的肌纤维被转染。最后，我们在此表明，与 LNPs 复合的 Cas9 mRNA 和 sgRNA 能够在子宫内编辑胎儿器官。这些实验证明了在子宫内非病毒递送 mRNA 到肝脏以外的器官的可能性，这为治疗出生前多种毁灭性疾病提供了一种有希望的策略。
利用 3D 肠组织模型研究脂质纳米粒子介导的基因组编辑蛋白质递送
脂质纳米颗粒是口服药物输送的有前途的载体。对于具有细胞内靶标的生物活性货物，例如基因编辑蛋白，货物和载体在穿过肠上皮层后保持复合状态至关重要，以便输送系统将货物运送到目标细胞内。然而，在验证货物/载体纳米复合物的完整性及其在纳米复合物穿过上皮屏障后促进货物在细胞内输送的能力方面，研究有限。在此，我们使用了传统的 2D 转小室系统和最近开发的 3D 组织工程肠模型，并证明了合成的脂质纳米颗粒（载体）和蛋白质（货物）纳米复合物能够穿过上皮层并将蛋白质货物运送到下面的细胞内。我们发现 EC16-63 LNP 可有效包裹 GFP-Cre 重组酶，通过暂时中断上皮层之间的紧密连接，在 2D 细胞培养和 3D 组织模型中均能穿透肠单层细胞。在穿过肠上皮后，EC16-63 和 GFP-Cre 重组酶纳米复合物可进入下层细胞，诱导基因重组。这些结果表明，体外 3D 肠组织模型可用于鉴定可用于潜在口服药物递送的有效脂质纳米颗粒。
CD34+ 造血干细胞和祖细胞体外编辑后 CRISPR 脱靶发现工具的比较分析
虽然存在多种研究 CRISPR 脱靶 (OT) 编辑的方法，但在临床相关编辑过程后，很少有方法在原代细胞中进行过头对头比较。因此，我们在体外造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 编辑后比较了计算机模拟工具 (COSMID、CCTop 和 Cas-OFFinder) 和经验方法 (CHANGE-Seq、CIRCLE-Seq、DISCOVER-Seq、GUIDE-Seq 和 SITE-Seq)。我们使用 11 种与 Cas9 蛋白复合的不同 gRNA（高保真 [HiFi] 或野生型版本）进行编辑，然后对通过计算机模拟和经验方法确定的指定 OT 位点进行靶向下一代测序。我们平均每个向导 RNA (gRNA) 识别出少于一个 OT 位点，使用 HiFi Cas9 和 20-nt gRNA 生成的所有 OT 位点都可通过除 SITE-seq 之外的所有 OT 检测方法识别。这导致大多数 OT 提名工具具有高灵敏度，并且 COSMID、DISCOVER-Seq 和 GUIDE-Seq 获得了最高的阳性预测值 (PPV)。我们发现经验方法无法识别生物信息学方法未识别的 OT 位点。这项研究支持可以开发出既能保持高灵敏度又能保持 PPV 的精细生物信息学算法，从而能够更有效地识别潜在的 OT 位点，而不会影响对任何给定 gRNA 的彻底检查。
四氢吡啶肢体抑制剂：结构活性研究和生物学特征
lim激酶，limk1和limk2，已成为开发抑制剂的有希望的靶标，并潜在地治疗多种主要疾病。limk在细胞骨架重塑中起着至关重要的作用，作为Rho-GTPase家族的小G蛋白的下游效应子，以及作为肌动蛋白去聚合因子Cofilin的主要调节剂。在本文中，我们描述了新型四氢吡啶吡咯吡汀limk抑制剂的概念，合成和生物学评估。同源性模型首先是为了更好地说明初步化合物的结合模式并解释生物学活性的差异。产生了60多种产品的文库，并在中低纳莫尔范围内测量了体外酶促活性。然后在Cofilin磷酸化Inhi Bition的细胞中评估了最有希望的衍生物，这导致了52的鉴定，该鉴定在激酶选择性面板中对LIMK表现出极好的选择性。我们还证明了52个通过干扰肌动蛋白丝影响细胞细胞骨架。使用该衍生物使用三种不同细胞系的细胞迁移研究对细胞运动表现出显着影响。 最后，解决了与52复合的Limk2的激酶结构域的晶体结构，从而大大改善了我们对52和Limk2活性位点之间相互作用的概念。 报告的数据代表了开发更有效的肢体抑制剂以用于未来体内临床前验证的基础。使用该衍生物使用三种不同细胞系的细胞迁移研究对细胞运动表现出显着影响。最后，解决了与52复合的Limk2的激酶结构域的晶体结构，从而大大改善了我们对52和Limk2活性位点之间相互作用的概念。报告的数据代表了开发更有效的肢体抑制剂以用于未来体内临床前验证的基础。
以及由Adeno介导的原发性和培养的肿瘤细胞...
我们已经使用阳离子脂质体来促进原代和培养细胞类型的腺相关病毒（AAV）质粒转染。AAV质粒DNA显示出比标准质粒的复合物高的表达水平。此外，观察到典型的脂质体介导的瞬时表达与标准质粒的转染所证明的瞬态表达不同，该基因的长期表达（> 30天）。染色体DNA的南部分析进一步证实了长期表达是由于AAV质粒转染组中的转基因而不是在标准质粒转染组中引起的。AAV质粒 - 脂质体复合物诱导的转基因表达水平与重组AAV转导相当。原发性乳房，卵巢和肺部肿瘤细胞可与AAV质粒DNA-脂质体复合物转染。转染的原发性和培养的肿瘤细胞即使在致命照射后也能够表达转基因产物。在正常人类外周血的新鲜分离的CD3+，CD4+和CD8+T细胞中也观察到了高级基因表达。转染效率范围为10％至501％，如白细胞介素2转染的细胞中细胞内白细胞介素-2水平评估。在原发性肿瘤和淋巴样细胞中表达转基因的能力可以应用于肿瘤疫苗研究和方案，最终可以对癌症和艾滋病中细胞免疫反应的高度特异性调节。