图1创建合成cAMP响应元件结合蛋白(CREB)响应启动子。(a)腺苷信号传导的描述。腺苷(红色球)结合腺苷受体A2AR/A2BR,该腺苷受体动员相关的G蛋白(绿色)激活腺苷酸环化酶(橙色受体),并将ATP转化为3'5'- 5'-循环腺苷单磷酸腺苷(Camp)。另外,福斯科蛋白(橙色球)可以直接激活腺苷循环酶。CAMP结合蛋白激酶A(PKA)与磷酸化的CREB,该CREB结合了Plindromic DNA基序“ TGACGTCA”,激活了基因表达。(b)启动子设计和筛选示意图。cAMP响应元件基序(CRE,突出显示的黄色)被克隆在3倍重复中,两侧是鸟嘌呤“ G”(带下划线),六个散布的填充核苷酸(N)。3x Cres(灰色正方形)放在核心启动子(蓝色箭头)上游的1-6个重复中。用高斯荧光素酶(GLUC)或绿色荧光蛋白(EGFP)定量启动子活性。(c,d)HEK293T细胞在96个井板中用指示的构建体(x轴)反向转染。转染后48小时,用车辆(DMSO,浅蓝色条)或20μm福斯科林(FSK,深蓝色条)将细胞介质更改为培养基。八个小时后,对培养基进行了采样并测试了GLUC活性(RLU)。条表示n = 3实验重复的平均值,误差线代表标准误差(SEM)。**通过方差分析(ANOVA)Tukey检验,与所有其他样本相比,表示P <0.01。(E,F)流式细胞仪启动子诱导。HEK293T细胞用96个井板中的指定构建体(x轴)反向转染。转染后48小时,细胞培养基被更改为未处理的培养基(浅蓝色条),或补充了0.750 m m m腺苷(ADO,深蓝色条)的培养基。八个小时后,将细胞胰蛋白酶胰蛋白酶进行胰蛋白酶,并将其重悬于FACS缓冲液中以进行流式细胞仪。y轴表示正向散射(FSC)单元的EGFP中位荧光强度。条代表n = 3实验重复的平均值,误差线代表SEM。(g)启动子对腺苷的剂量反应性。HEK293T细胞在96个井板上反向转染,并在传说中指示的构造,然后培养48小时。然后更改培养基以添加不同的腺苷浓度,在8小时后进行采样,并测试了GLUC活性(RLU)。**通过12倍-CRE_YB的ANOVA TUKEY测试代表P <0.01,与1 m m的所有其他样品相比。每个点表示n = 3实验重复的平均值,误差线为SEM。
图1 - 反思积分控制器和强大的完美适应。a)反思积分控制器是一个负反馈回路(闭环),其中组成型表达的激活剂物种X驱动了感兴趣的Z(输出)的表达。z驱动抑制剂y的表达,该抑制剂y结合并抑制X。当z的浓度变化时,y也会导致x以相反的方式变化(例如如果z的浓度降低,则活性x将增加,反之亦然)。该机制使反思积分控制器在扰动(红线)面对面的Z(实心橙色线)的浓度(固体橙色线)(红线),从而使Z恒定随着时间的推移保持恒定。在开放环配置中,Z是从组成型启动子直接表达的,如果由于外部扰动(红线)而其浓度降低(红线),其浓度随着时间的流逝不会恒定(虚线橙色线)。b)我们实施中的物种本身就是转录激活剂,并且可以通过将发光萤火虫荧光素酶(FLUC)放置在由Z驱动的启动子下,或直接将EGFP Pluorescent Reporter融合到Z本身的启动子中,可以间接地跟踪其浓度。
摘要:前连合(AC)是一束轴突,它们在嗅觉区域(例如嗅球(OB),前嗅觉核(AON)和梨状皮层(PC)等嗅觉区域之间交流,在嗅觉区域之间进行交流。以前,我们报道说,AC的发展是一个高度调节的过程,涉及渐进式和回归的增长策略,在E17胚胎开发结束时达到对侧。同时,对侧结构中的树博化延迟到产后3-5天。在这里,我们使用与EGFP或MCHERRY转导的腺相关病毒(AAVS)向量,我们在OB,AON和PC中注入了嗅觉区域,以研究穿过AC的对侧神经支配场。我们发现,来自OB的对侧轴突仅穿过AC的前肢,以投射到颗粒细胞层(GCL)中。相比之下,轴突源自前PC项目,进入对侧OB,AON和PC。这些轴突不仅将其释放到GCL中,还可以伸入二尖瓣和外部丛状层,以及前PC层1B。,我们通过AC的后肢专门观察到后PC项目,专门于对侧PC,从1B层进行了根本性的塑造。内一核核仅通过AC的后肢向后PC进行。共同展示了嗅觉结构中对侧树博化的详细图,这对于理解脑半球之间嗅觉信息的处理至关重要。
醋酸,丙酸酯和丁酸酯的短链脂肪酸(SCFAS)是饮食纤维的肠道微生物发酵的主要产物,通过肠脑轴涉及微调脑功能。然而,SCFA在调节几种自主脑功能的下丘脑神经元网络中的影响仍然未知。使用NMR光谱法,我们检测到肥胖的瘦素基因敲除ob/ob小鼠的脑乙酸盐浓度降低,与瘦野生型同窝仔相比。因此,我们研究了乙酸盐对乙蛋白/低钙蛋白神经元(以下称为OX或OX-A神经元)的作用,这是调节能量稳态的低丘脑神经元的子集,我们在先前的研究中表征了瘦素缺乏瘦素和肥胖型肥胖型肥胖症的影响,而这些研究被过度激活。我们发现,乙酸盐会减少与OB/ OB小鼠中OREXIN神经元活性降低的伴随中的食物感染。通过评估食物智能行为和Orexin-A/c-Fos免疫反应性以及HCRT -EGFP神经元中的贴片钳记录,预脱蛋白mRNA的量化以及对GPR-43的nolabeling contification coppliation。我们的数据提供了有关乙酸或复杂碳水化合物对能量摄入和体重的慢性饮食补充作用机制的新见解,这可能部分是通过抑制甲状腺素能神经元活性介导的。
摘要:Cas9(DCAS9)核酸内切酶的催化无效突变体具有多种生物医学应用,最有用的是转录的激活/抑制。dcas9家族成员也正在成为潜在的实验工具,用于在独立活细胞和完整组织的水平上进行基因映射。我们对CAS9介导的核室可视化的一组工具进行了初步测试。我们研究了doxycycline(DOX) - 可诱导(TET-ON)的细胞内分布,这些构建体的构造中编码DCAS9直系同源物(ST)(ST)和脑膜炎N.脑膜炎(NM)与EGFP和MCHERRY FOLORESCENT蛋白(FP)融合的人类A549细胞。我们还研究了这些嵌合荧光构建体的时间依赖性表达(DCAS9-FP)在活细胞中诱导中的诱导中,并将其与实验性DCAS9-FP表达的时间过程进行了比较灌注。在诱导后24小时内,肿瘤异种移植物发生了麦克利 - 奇氏菌表达的体内诱导,并通过使用皮肤的光学清除(OC)来可视化。OC通过局部应用Gadobutrol启用了肿瘤异种移植物中FP表达的高对比度成像,因为红色和绿色通道的FI增加了1.1-1.2倍。
中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞是生产生物治疗药物的最重要平台。转基因随机整合到基因组表观遗传不稳定区域会导致目的基因沉默和上游加工过程中生产力损失。因此,必须进行成本高、时间密集的长期稳定性研究。位点特异性整合到安全港是一种克服传统细胞系设计这些局限性的策略。最近的出版物根据组学数据集或通过从随机整合中学习来预测 CHO 细胞中的安全港,但这些预测仍然只是理论。在本研究中,我们基于 ChIP-seq 数据建立了 CRISPR/Cas9 介导的位点特异性整合策略,以提高重组 CHO 细胞的稳定性。因此,从 CHO-K1 细胞的补料分批培养的指数和稳定生长期进行的 ChIP 实验产生了 709 个潜在的稳定整合位点。报告基因 eGFP 通过 CRISPR/Cas9 整合到三个含有特定修饰的区域。靶向 Cas9 纳米孔测序显示所有 3 个细胞池中均存在位点特异性整合,特异性在 23% 到 73% 之间。随后,将具有三个不同整合位点的细胞与随机整合的供体载体在转录水平、生产力、基因拷贝数和稳定性方面进行比较。所有位点特异性整合均显示生产力和转录水平增加了高达 7.4 倍。在超过 70 代的长期培养中,两个位点特异性整合显示出稳定的生产力(> 70%),不受选择压力的影响。
乳腺癌是一种复杂的异质疾病,具有独特的分子亚型,它限制了每个亚型的优化治疗策略的发展。癌症基因疗法和晚期/难治性癌症的潜在疗法可能有望成为乳腺癌。结合了肿瘤 - 循环脂质纳米颗粒(LNP)和诱导的caspase-9(IC9)mRNA,我们旨在制定一种新型的治疗策略,以解决难治性乳腺癌。LNP的抗肿瘤作用:MDA-MB231,SKBR3和MCF-7。肿瘤细胞。通过逆转录酶定量PCR评估了与凋亡相关的基因。lnps可以有效地将包裹的GFP mRNA传递给所有三种癌细胞系(> 80%GFP表达。在目标细胞中)。此外,用IC9 mRNA(IC9-LNP)和CID封装的LNP在体外对所有癌细胞系显示了细胞毒性活性。有趣的是,在癌细胞系中,对IC9基因疗法的敏感性是良好的。IC9-LNP具有CID诱导的对SKBR3和MDA-MB231细胞的有效细胞毒性作用,但仅对MCF7细胞产生轻度的细胞毒性作用。量化相关基因的定量表明,高BAX/BCL-2比率可能与IC9-LNPÞCID易感性有关。 因此,使用IC9-LNP和CID的癌症基因治疗可能是治疗乳腺癌的有希望的替代方法,尤其是对于侵略性乳腺癌而言。 ©2022 Elsevier Inc.保留所有权利。量化相关基因的定量表明,高BAX/BCL-2比率可能与IC9-LNPÞCID易感性有关。因此,使用IC9-LNP和CID的癌症基因治疗可能是治疗乳腺癌的有希望的替代方法,尤其是对于侵略性乳腺癌而言。©2022 Elsevier Inc.保留所有权利。
(www.pichia.com),在这种酵母中成功表达了5000多种不同的蛋白质(Schwarzhans等,2017)。在P. p. p. p. p. p. p. p. p. p. opterer工程中的典型策略包括启动子工程(Nong等,2020; Lai等,2024; Zhou等,2023),信号肽修改(Lie等,2015),拷贝数的增加(Liu等,2020年; putteas et ease; wang al。 2019年),以及伴侣因子的引入(Zheng等,2019;Raschmanová等,2021)。 但是,基因组中的直接基因敲除可以导致P. P. P. P. P. p. p. pastoris代谢途径内的特定功能的丧失,从而破坏其整体代谢网络。 相比之下,利用合成生物学工具调节基因表达可能比传统的敲除或过表达方法更有效。 基因表达调节是许多细胞过程的基础(De Nadal等,2011; Nielsen和Keasling,2016年)。 当前,微生物中基因调节的主要工具是定期间隔短的短质体重复序列(CRISPR)系统的。 但是,使用CRISPR进行基因激活或抑制通常需要在CRISPR系统中蛋白质失活,添加激活或抑制域,以及仔细选择合适的SGRNA靶位点。 因此,CRISPR系统相对复杂且耗时。 此外,CRISPR的应用还受到宿主细胞接受度,异物蛋白质表达效率和目标位点选择准确性等因素的影响,这使得优化过程更加繁琐。在P. p. p. p. p. p. p. p. p. p. opterer工程中的典型策略包括启动子工程(Nong等,2020; Lai等,2024; Zhou等,2023),信号肽修改(Lie等,2015),拷贝数的增加(Liu等,2020年; putteas et ease; wang al。 2019年),以及伴侣因子的引入(Zheng等,2019;Raschmanová等,2021)。但是,基因组中的直接基因敲除可以导致P. P. P. P. P. p. p. pastoris代谢途径内的特定功能的丧失,从而破坏其整体代谢网络。相比之下,利用合成生物学工具调节基因表达可能比传统的敲除或过表达方法更有效。基因表达调节是许多细胞过程的基础(De Nadal等,2011; Nielsen和Keasling,2016年)。当前,微生物中基因调节的主要工具是定期间隔短的短质体重复序列(CRISPR)系统的。但是,使用CRISPR进行基因激活或抑制通常需要在CRISPR系统中蛋白质失活,添加激活或抑制域,以及仔细选择合适的SGRNA靶位点。因此,CRISPR系统相对复杂且耗时。此外,CRISPR的应用还受到宿主细胞接受度,异物蛋白质表达效率和目标位点选择准确性等因素的影响,这使得优化过程更加繁琐。在基因激活中,需要引入其他转录激活剂,而在基因抑制中,抑制因子必须进行精确设计和交付,以确保特定的调节。因此,尽管具有强大的基因调控能力,但CRISPR系统的操作复杂性和时间成本很高(Casas-Mollano等,2020; Chen等,2020)。相比,RNA干扰(RNAi)直接靶向RNA,影响蛋白质翻译,并为基因调节提供了更简单的方法。RNAi是一种由双链RNA(DSRNA)激活的基因沉默途径(Drinnenberg等,2009),由核糖核酸酶III(RNAseIII)酶处理,该酶加工成小型小型干扰RNA(sirnas)。dicer是一种酶,可将双链RNA裂解成小siRNA片段。这些siRNA随后引导参与RNA裂解的Argonaute蛋白靶向和裂解转录本,有效地沉降基因表达(Wang等,2019)。RNAi系统及其基本组件(dicer,argonaute和sirnas)通过简单的质粒转化步骤提供了一种更直接和灵活的方法来沉默基因。这减少了时间和精力,从而促进了各种菌株基因抑制策略的快速发展(Crook等,2014)。本报告详细介绍了P. P. P. P. P. rnai系统的第一个建立。可以创建这样的系统的假设是基于观察结果,即引入Argonaute蛋白和siRNA到P. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. apastoris。基因修饰的P. p. p. p. p. p. press这表明在P. Pastoris基因组中编码丁香样蛋白的基因的潜在存在。这项研究成功地证明了通过引入Hairpin RNA通过RNAi系统抑制单基因(增强的绿色荧光蛋白(EGFP))和双基因(EGFP /组氨酸(His))。
转录后基因调节,包括RNA结合蛋白(RBP),最近被描述为癌症的重要机制。我们以前已经确定了一组RBP,这些RBP在B细胞急性淋巴细胞白血病(B-All)中具有高度失调的RBP,其预后较差。在这里,我们试图通过在B-all细胞系中进行重点的CRISPR辍学屏幕来在功能上表征这些失调的RBP基因,从而发现对包括EIF3E,EPRS和USO1在内的多种基因的依赖性。验证了我们的发现,CRISPR/CAS9介导的USO1在MLL易位的B-ALL细胞中造成的破坏可降低细胞生长,促进细胞死亡并改变细胞周期。对USO1缺陷细胞的转录组分析显示,与MTOR信号传导,RNA代谢和MYC靶标有关的途径发生了变化。此外,这些实验样品中USO1调节的基因在B-All患者收集的主要样本中与USO1表达显着,并一致相关。最后,我们发现USO1的损失抑制了来自Cas9 -EGFP小鼠的原代骨髓细胞中MLL的菌落形成。一起,我们的发现证明了一种执行集中的亚基因组CRISPR筛选的方法,并突出了MLL转移的B-All中推定的RBP脆弱性,从而鉴定了该疾病中的潜在治疗靶标。
摘要B-千奇蛋白具有重要的生态和生理作用以及广泛应用的潜力,但是很少有来自B-奇异生产剂的差异相关酶的表征。针对Tara Oceans基因地图集的查询,在芽孢杆菌元转录组中发现了来自12个PFAM接收器的4,939个与丁氏蛋白相关的独特序列。假定的几丁质合酶(CHS)序列在甲壳类(39%),斯特雷默刺激(16%)和昆虫(14%)中降低,来自Tara Oceans Unigenes Unigenes Unigenes Unigenes Unigenes版本1 Metatranscrentsomes(Matouv1 1 T)数据库的昆虫(14%)。从模型diatom thalassiosira pseudonana(thaps3_j4413,指定为tp chs1)中的CHS基因被鉴定。海洋微生物真核生物转录组测序项目(MMETSP),Phycocosm和Plaza Diotom Omics数据集的TP CHS1的同源分析表明,Mediophyceae和thalassionemales物种是潜在的B -Chitin生产国。tp chs1在酿酒酵母和三角肌中过表达。在转基因P. tricornutum系中,TPCHS1- EGFP定位于高尔基体和质膜,并且在细胞分裂期间的裂解沟中主要可获得。增强的TP CHS1表达可以诱导异常的细胞形态并降低三角杆菌的生长速率,这可能归因于G2/M期的抑制。S.酿酒酵母被证明是表达大量活性TPCHS1的更好系统,在放射测定中,在放射测定中有效地不合适的UDP-N-乙酰葡萄糖胺。我们的研究扩大了有关海洋真核微生物中几丁质合酶分类分布的知识,并且是第一个集体表征活性海洋硅藻CHS的知识,该硅藻可能在细胞分裂过程中起重要作用。