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辅助功能与哑铃 -
摘要：共价闭合的哑铃形DNA递送载体，包括双端的双链基因和两端的单链发夹环，代表了一种安全，稳定且有效的替代病毒和其他基于非病毒DNA的矢量系统。与质粒和DNA微圆相反，哑铃可以通过辅助函数通过环与靶向递送或成像结合。在这里，我们研究了三年期N-乙酰乳糖苷（GALNAC3）或CD137/4-1BB结合适体（APTCD137-2）的同二聚体的非共价连接，以通过与诸如寡核的元素交付或耐心的近似元素送达或纳入的dumbbell vector vector循环。将哑铃环的大小从4个核苷酸扩大到71个核苷酸并不会损害基因表达。GalNAC3和APTCD137-2残基通过互补寡核苷酸成功地连接到扩展的哑铃环上。DNA和RNA寡核苷酸基基核苷酸 - GALNAC3共轭物被肝母细胞瘤衍生的人体组织培养细胞（HEPG2）从细胞培养基中吸收，具有可比的效率。RNA寡核苷酸连接的共轭物触发了稍高的基因表达水平，这可能是由于RNASEH介导的接头裂解，GALNAC3残基中的哑铃释放，以及更多的未偶联哑铃DNA的核靶标。在体外确认了RNASEH触发的RNA接头裂解。最后，我们以表达肝癌细胞特异性RNA反式解放的自杀RNA和GalNAC3残基的哑铃载体。哑铃与两个GalNAC3残基共轭时，当添加到细胞培养基中时，触发了显着水平的细胞死亡。哑铃矢量偶联物可以探索靶向递送和基因治疗应用。
果蝇中的单个转录本的组合遗传扰动的多顺基因转基因设计
捕获人类疾病遗传复杂性并允许对基础细胞，组织和器官相互作用进行机械探索的实验模型对于使我们对疾病生物学的理解至关重要。这样的模型需要对多个基因的组合操作，通常是一次以上的组织。在体内进行复杂的遗传操作的能力是果蝇的关键优势，其中许多用于复杂和正交遗传扰动的工具。然而，在这些已经复杂的遗传背景中建立更多代表性疾病模型和进行机械研究所需的大量转基因是具有挑战性的。在这里，我们提出了一种设计，该设计通过允许靶向组合异位表达和来自单个诱导型转基因的多个基因敲低的靶向组合异位表达来推动果蝇遗传学的极限。由该转基因编码的多余体转录本包括一个合成的短发夹簇，它克隆在转录本的5'末端的内含子中，然后是两个蛋白质编码序列，该蛋白质编码序列由介导核糖体跳过的T2A序列分开。这项技术对于建模癌症等遗传复杂疾病特别有用，癌症通常涉及多发性肿瘤基因的同时激活和多PLE肿瘤抑制剂的丧失。此外，将多种遗传扰动巩固到single转基因中，进一步简化了执行组合遗传操作的能力，并使其很容易适应广泛的转基因系统。这种用于组合遗传扰动的灵活设计也将是一种有价值的工具，用于探索从人类疾病的OMICS研究中鉴定出的多基因基因特征并创建人源化的果蝇模型，以表征人类基因中与疾病相关的变体。它也可以适用于研究正常组织稳态和发展需要同时操纵许多基因的生物学过程。
PD-1下调通过保留细胞记忆表型并减少疲惫来提高CAR-T细胞抗肿瘤效率
抽象的背景尽管在管理复发或难治性多发性骨髓瘤（RRMM）患者方面靶向B细胞成熟抗原（BCMA）的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）的结果令人鼓舞，但Cart-T细胞的治疗副作用和功能障碍限制了这种有望的方法的效率和临床应用。在这项研究中，我们将靶向PD-1的短发夹RNA盒纳入了具有OX-40共刺激结构域的BCMA车。在暴露于单个或重复的抗原刺激下，评估了转导的PD-1 KD CAR-T细胞的表面CAR表达，T细胞增殖，细胞毒性，细胞因子产生和亚群。在RRMM患者的I期临床试验中最初观察到安全性和功效。与亲本BCMA CAR-T细胞相比，PD-1 KD BCMA CAR-T细胞疗法显示，T细胞疲劳减少，体外记忆T细胞的百分比增加。在PD-1 KD BCMA CAR-T组中，还观察到体内更好的抗肿瘤活性。在七名RRMM患者的CAR-T细胞疗法的I期临床试验中，最初在所有七名患者中观察到安全性和功效，其中包括至少1名患者（4/7，57.1％），其中1例至少有1名患者和四名患者（4/7，57.1％），具有高风险的细胞遗传学。总回应率为85.7％（6/7）。四名患者有严格的完全反应（SCR），一名患者患有CR，一名患者有部分反应，一名患者患有稳定的疾病。的安全性，其发生率是轻度至中度细胞因子释放综合征，并且没有神经毒性的发生。结论我们的研究表明了独立于抗原特异性的CAR-T细胞的设计概念，并提供了提高CAR-T细胞疗法功效的替代方法。
人胎盘中合成肌细胞细胞谱系发育的关键调节剂
背景。胎盘是一种瞬态器官，在怀孕期间形成以支持胎儿发育并调节影响慢性疾病风险的环境线索的暴露。胎盘在许多方面支持胎儿发育，包括促进营养和氧气交换，去除有害废物产品，产生关键的激素（例如人类绒毛膜促性腺激素）以及提供免疫保护。这些功能在很大程度上是由被称为合胞素细胞和额外滋养细胞细胞的终末分化的滋养细胞执行的。尽管合成肌细胞细胞和跨性滋养细胞细胞的重要性，但仍不清楚它们如何专门支持最佳胎儿发育。目标。使用功能方法丧失来确定合成肌细胞细胞谱系发育的转录调节因子。方法。候选转录因子（TBX3，VGLL3和ATF3）使用慢病毒介导的短发蛋白RNA（SHTBX3，SHTBX3，SHVGLL3或SHATF3）使用胞质衍生的人滋养细胞干细胞中击倒。将非特异性shRNA（SHCONTROL）用作对照。转导后，使用紫霉素选择细胞，并分别通过RT-QPCR和Western印迹在转录本和蛋白质水平上确认敲低效率。通过功能和转录组评估评估了转录因子敲低对滋养细胞干细胞分化为合成型肉芽细胞的影响。结果。结论。未来的方向。与用SHControl转导的细胞相比，SHTBX3和SHVGLL3的转导在合成型细胞细胞分化后导致形态异常。 可以使用滋养细胞干细胞中的功能方法丧失来评估候选转录调节剂对合成细胞细胞谱系发育的关键贡献。 初步结果表明，TBX3和VGLL3对于建立合成型细胞细胞谱系至关重要。 然而，需要更深入的表征来识别TBX3和VGLL3调节合成细胞成分的发育的分子机制。 未来的研究将包括完成剩余的候选转录因子，ATF3，全基因组评估（例如ATAC-SEQ）的shRNA敲低，以及所有SHRNA转换的其他功能输出，例如人类绒毛膜促性腺激素的产生。在合成型细胞细胞分化后导致形态异常。可以使用滋养细胞干细胞中的功能方法丧失来评估候选转录调节剂对合成细胞细胞谱系发育的关键贡献。初步结果表明，TBX3和VGLL3对于建立合成型细胞细胞谱系至关重要。然而，需要更深入的表征来识别TBX3和VGLL3调节合成细胞成分的发育的分子机制。未来的研究将包括完成剩余的候选转录因子，ATF3，全基因组评估（例如ATAC-SEQ）的shRNA敲低，以及所有SHRNA转换的其他功能输出，例如人类绒毛膜促性腺激素的产生。
体外 CRISPR/CasRx 介导的 RNA 编辑方法
与使用 CRISPR/Cas 系统进行 DNA 操作不同，关于基于 CRISPR/Cas 的 RNA 修饰的文献严重缺乏。最近，科学家对 Cas13 酶进行了表征，并证明可编程 RNA 编辑在效率和特异性方面优于现有的 RNA 靶向方法（Abudayyeh 等人，2017 年；Cox 等人，2017 年；Liu 等人，2017 年；Konermann 等人，2018 年）。据报道，由于缺乏基因组改变，CRISPR/Cas13 也比现有的 CRISPR/Cas 系统更安全。2018 年，最小的 RNA 靶向 Cas 核酸酶 Cas13d 被描述。在 Cas13d 家族中，来自 Ruminococcus flavifaciens 的 CasRx（也称为 RfxCas13d）具有最高的 RNA 裂解活性和在人类细胞中的特异性。CasRx 的 RNA 靶向也比短发夹 RNA (shRNA) 干扰效果更好。重要的是，Cas13d 核酸酶可以处理 CRISPR 阵列，从而实现多重靶向（Konermann 等人，2018 年）。随后对 CasRx 的研究表明，在各种动物模型中可以有效地敲低信使 RNA (mRNA)，并在植物中实现转基因表达（Mahas 等人，2019 年；Kushawah 等人，2020 年）。值得注意的是，使用 AAV 载体在新生血管性年龄相关性黄斑变性 (nAMD) 小鼠模型中证明了 CRISPR/CasRx 的治疗潜力。 CRISPR/CasRx 系统的递送成功抑制了血管内皮生长因子 (VEGF) 的 mRNA，这是致病性眼部血管生成的关键因素，并且随后显示出脉络膜新生血管 (CNV) 面积的减少，这是 nAMD 的标志 ( Zhou et al., 2020 )。这些研究表明 CRISPR/CasRx 系统的治疗潜力。在这里，我们描述了三种不同的方法来有效地进行 CRISPR/CasRx 介导的血管内皮生长因子 A (VEGFA) 的 RNA 敲低。我们通过靶向 VEGFA mRNA，使用不同形式的单向导 RNA (sgRNA) 检查了 CRISPR/CasRx 系统的 RNA 敲低效率。为了应用于治疗学开发，我们生成了由 CasRx 和单个前 sgRNA 或多个前 sgRNA（阵列）组成的一体化 AAV 构建体，以检查系统的 RNA 敲除效率。本文介绍了使用 CasRx 和向导 RNA 变体进行体外 RNA 编辑的指导手册。
一天内构建多重阵列以利用天然 CRISPR 系统
摘要 CRISPR-Cas 系统是一种原核免疫系统，不仅在细菌和古细菌中广泛增殖，而且最近在人类生物学研究和应用中也广泛存在。迄今为止，许多工作都利用了合成的 sgRNA 和 CRISPR 核酸酶 Cas9，但阵列处理核酸酶的发现现在允许在异源宿主以及具有内源系统的生物体中使用更紧凑、天然的 CRISPR 阵列。不幸的是，多重天然 CRISPR 阵列的构建在技术上仍然具有挑战性、成本高昂和/或耗时。这种限制阻碍了在天然和异源宿主中涉及天然 CRISPR 阵列的研究。为了解决这个问题，我们提出了一种组装 CRISPR 阵列的方法，这种方法简单、快速、经济实惠且高度可扩展——我们用一天的工作组装了 9 间隔阵列。我们利用这种方法来利用高能力细菌 Acinetobacter baylyi 的内源性 CRISPR 系统，结果表明虽然单个间隔区并不总是能够完全有效地阻止通过天然能力获取 DNA，但多重天然 CRISPR 阵列可以实现几乎完全的 DNA 排除和基因组编辑，包括两者的多个靶标。除了展示一种将使各种应用受益的 CRISPR 阵列组装方法之外，我们还发现了一种潜在的对冲策略，用于平衡 CRISPR 防御与天然能力的 A. baylyi 中的 DNA 获取。CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）-Cas 系统是一种适应性免疫机制，通常通过检测和切割确定的靶序列 1 来保护细菌和古菌免受核酸入侵。CRISPR 系统包括 Cas（CRISPR 相关）蛋白，以及与同样短的 DNA 间隔区交替的同名短直接重复序列阵列。间隔序列被转录成较长的前体crRNA，然后前体crRNA被加工成单个crRNA（CRISPR RNA），每个crRNA由与特定核酸靶标互补的单个间隔序列以及通常源自重复序列的发夹柄组成。这些crRNA与Cas效应蛋白（如Cas9）或蛋白质复合物（如CASCADE）结合。一旦结合，它们就会根据系统引导效应子到互补的DNA或RNA上，效应子通常会切割这些DNA或RNA。很快，许多实验室就将CRISPR介导的DNA切割应用于从精确的基因组工程到基因回路2到靶向的细菌菌株去除3-6等各种应用。自扩散的CRISPR构建体也被用于快速产生纯合二倍体敲除（诱变链式反应）7，初步研究表明
RNA二级结构预测中实验证据的限制
化学和酶促探测作为RNA二级结构信息的实验来源的历史悠久。近年来，此类方案与高通量测序方法相连，以提供对整个转录组结构信息的访问（Kubote等，2015； Carlson等，2018）。尽管结构探测的有用性无可争议，但重要的是要记住，任何探测方法提供了一个编码RNA结构信息的信号，但远离直接测量或明确确定结构的信号。RNA结构的广泛经验证据已被整合到RNA二级结构预测的“标准模型”中。It de fi nes an RNA secondary structure as a collection of Watson-Crick and GU base pairs such that i) each base has at most one pairing partner, ii) base pairs do not cross, i.e., if ( i , j ) is a pair, then there is no pair ( k , l ) with i < k < j and l < i or l > j , and iii) every base pair spans at least three unpaired positions ( Lorenz et al., 2011 ）。这种类型的每种结构都与可以计算为其循环总和（其独特平面嵌入的一个方面）的能量相关联，该能量对应于堆叠的碱基对，发夹环，内部环和多支线环路。每个循环的能量贡献取决于其顺序，但独立于其外部环境。从序列依赖性环能贡献的综合表中（主要是）通过在小型，特定的设计RNA分子上进行的熔化实验（Andronescu等，2014）。（Turner and Mathews，2010年），它们用于确切的动态编程算法，这些算法预测了任意RNA序列的辅助结构的玻尔兹曼集合中的基态结构或基本配对概率。我们注意到随机上下文无语法（SCFG）在本质上使用相同的模型（Rivas等，2012），并且可以作为热力学方法的替代方法。通常，使用已知结构的学习方法进行参数化，例如，参见（Do等，2006）。出于当前贡献的目的，只有一个“通用”模型可以预测（合理的近似值）二级结构以任意RNA序列为输入。经验证据，例如，从探测实验中可以包括在普遍的结构预测方法中，作为与经验证据相矛盾或额外能量项（软约束）相矛盾的硬性约束结构，偏爱与其他结构更好地符合其他经验数据的结构，请参见，例如，请参见，例如（Lorenz等，
植物免疫中的RNA沉默：超越武器竞赛？
植物免疫中的RNA沉默：超越武器竞赛？Sara Lopez-Gomollon，David C Baulcombe *植物科学系，剑桥大学，唐宁街，剑桥CB2 CB2 CB2 3EA UK *通信D.C.B.：dcb40@cam.ac.uk摘要RNA沉默已被很好地确定为植物中的一种抗病毒系统，在该植物中，小（S）RNA指导防御靶标对病毒RNA或DNA中的靶标的Argonaute蛋白效应子。病毒编码的沉默抑制剂抵消了这种防御系统。本综述总结了有关抗病毒RNA沉默的最新发现，包括RNA通过plasmodesmata的运动以及植物如何区分自我与病毒RNA。我们还描述了新兴的图片，即除抗病毒防御外，RNA沉默在针对非病毒病原体的植物免疫力中发挥作用。通过囊泡和其他结构以及通过这些生物体编码的沉默抑制器的作用，RNA向感染的植物细胞向感染的植物细胞的反式运动介导了这种对一般免疫力的影响。也存在RNA沉默对一般免疫力的影响，因为宿主编码的SRNA，包括微（MI）RNA，调节植物先天免疫系统中的类似点状受体和防御信号通路。这些RNA沉默途径构成了一个过程网络，对植物的免疫状态具有正面和负面影响。引言植物中的RNA沉默首先被确定为转基因和病毒感染的转录后机制1,2。它是由病毒或转基因RNA触发的，关键的中间分子是双链（DS）或DICER的发夹RNA底物（植物中的DCL）。在某些系统中，DSRNA由作用于单个链分子的RNA依赖性RNA聚合酶（RDR）产生，而21-24NT RNA DCL衍生的片段通常称为小（S）RNA（Box 1）。这些片段的单链衍生物与Argonaute（AGO）蛋白形成核蛋白，它们通过Watson-Crick Base配对引导它们以靶向RNA。agos是核酸酶，在规范的RNA沉默中（图1A），靶RNA被裂解SRNA的相反位置10，尽管存在如下所述的变体机制。该系统在抗病毒防御中有效，因为特异性是由源自病毒基因组的SRNA赋予的。由于每个双链RNA的DICER裂解成多个SRNA（Box 1），它也具有扩增属性。此外，SRNA在细胞之间是可移动的，因此它们可以在感染前部或前方或前方的病毒RNA和Prime Agos之前移动或前进（图1B）。与其他防御系统一样，带有RNA沉默，并且与宿主病原体相互作用的“武器竞赛”概念一致，病毒编码了抑制器，这些抑制器抵消了RNA沉默3-5的防御作用（Box 2和图2）。包括蠕虫，昆虫和哺乳动物在内的动物在感染细胞中产生病毒SRNA 2,6,7，对病毒的保护很可能是RNA的保守而古老的作用
引用Ruan S，He C，Wang A，Lin Y和Liang S（2025）在Pichia Pastoris中建立和应用RNAi系统。正面。 Bioeng。生物技术
（www.pichia.com），在这种酵母中成功表达了5000多种不同的蛋白质（Schwarzhans等，2017）。在P. p. p. p. p. p. p. p. p. p. opterer工程中的典型策略包括启动子工程（Nong等，2020; Lai等，2024; Zhou等，2023），信号肽修改（Lie等，2015），拷贝数的增加（Liu等，2020年； putteas et ease; wang al。 2019年），以及伴侣因子的引入（Zheng等，2019;Raschmanová等，2021）。 但是，基因组中的直接基因敲除可以导致P. P. P. P. P. p. p. pastoris代谢途径内的特定功能的丧失，从而破坏其整体代谢网络。 相比之下，利用合成生物学工具调节基因表达可能比传统的敲除或过表达方法更有效。 基因表达调节是许多细胞过程的基础（De Nadal等，2011； Nielsen和Keasling，2016年）。 当前，微生物中基因调节的主要工具是定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）系统的。 但是，使用CRISPR进行基因激活或抑制通常需要在CRISPR系统中蛋白质失活，添加激活或抑制域，以及仔细选择合适的SGRNA靶位点。 因此，CRISPR系统相对复杂且耗时。 此外，CRISPR的应用还受到宿主细胞接受度，异物蛋白质表达效率和目标位点选择准确性等因素的影响，这使得优化过程更加繁琐。在P. p. p. p. p. p. p. p. p. p. opterer工程中的典型策略包括启动子工程（Nong等，2020; Lai等，2024; Zhou等，2023），信号肽修改（Lie等，2015），拷贝数的增加（Liu等，2020年； putteas et ease; wang al。 2019年），以及伴侣因子的引入（Zheng等，2019;Raschmanová等，2021）。但是，基因组中的直接基因敲除可以导致P. P. P. P. P. p. p. pastoris代谢途径内的特定功能的丧失，从而破坏其整体代谢网络。相比之下，利用合成生物学工具调节基因表达可能比传统的敲除或过表达方法更有效。基因表达调节是许多细胞过程的基础（De Nadal等，2011； Nielsen和Keasling，2016年）。当前，微生物中基因调节的主要工具是定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）系统的。但是，使用CRISPR进行基因激活或抑制通常需要在CRISPR系统中蛋白质失活，添加激活或抑制域，以及仔细选择合适的SGRNA靶位点。因此，CRISPR系统相对复杂且耗时。此外，CRISPR的应用还受到宿主细胞接受度，异物蛋白质表达效率和目标位点选择准确性等因素的影响，这使得优化过程更加繁琐。在基因激活中，需要引入其他转录激活剂，而在基因抑制中，抑制因子必须进行精确设计和交付，以确保特定的调节。因此，尽管具有强大的基因调控能力，但CRISPR系统的操作复杂性和时间成本很高（Casas-Mollano等，2020； Chen等，2020）。相比，RNA干扰（RNAi）直接靶向RNA，影响蛋白质翻译，并为基因调节提供了更简单的方法。RNAi是一种由双链RNA（DSRNA）激活的基因沉默途径（Drinnenberg等，2009），由核糖核酸酶III（RNAseIII）酶处理，该酶加工成小型小型干扰RNA（sirnas）。dicer是一种酶，可将双链RNA裂解成小siRNA片段。这些siRNA随后引导参与RNA裂解的Argonaute蛋白靶向和裂解转录本，有效地沉降基因表达（Wang等，2019）。RNAi系统及其基本组件（dicer，argonaute和sirnas）通过简单的质粒转化步骤提供了一种更直接和灵活的方法来沉默基因。这减少了时间和精力，从而促进了各种菌株基因抑制策略的快速发展（Crook等，2014）。本报告详细介绍了P. P. P. P. P. rnai系统的第一个建立。可以创建这样的系统的假设是基于观察结果，即引入Argonaute蛋白和siRNA到P. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. p. apastoris。基因修饰的P. p. p. p. p. p. press这表明在P. Pastoris基因组中编码丁香样蛋白的基因的潜在存在。这项研究成功地证明了通过引入Hairpin RNA通过RNAi系统抑制单基因（增强的绿色荧光蛋白（EGFP））和双基因（EGFP /组氨酸（His））。
发夹和剪刀 - 为大众提供非基因编辑的同种异体 CAR-T 细胞疗法 David Gilham Celyad Oncology 首席科学官
概述 两种嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法获批用于治疗 B 细胞恶性肿瘤，凸显了细胞免疫疗法在提供令人印象深刻的持久临床反应方面的潜力 1 。这些产品本质上是自体的，涉及从患者身上收集用于制造 CAR T 细胞的免疫细胞。一旦生产出来，这些 CAR T 细胞就会作为临床产品重新注入患者体内。然而，自体疗法面临着重大挑战，包括产品生产时间（目前需要数周），在此期间患者的病情可能会恶化，以及起始材料的质量高度不稳定，这可能导致制造失败。同种异体 CAR T 细胞疗法是一种现成的方法，可以在需要时进行管理，是理想的解决方案。这种方法从健康供体中生成细胞，形成一个 CAR T 细胞库，可根据需要使用。同种异体 CAR T 的关键挑战是克服与同种异体 CAR T 细胞识别健康患者组织相关的毒性。这是由 T 细胞受体 (TCR) 介导的。破坏 TCR 是所有当前同种异体 CAR-T 策略的基础 2 。发夹和剪刀目前，用于生成同种异体 CAR-T 的基因编辑技术处于临床开发的早期阶段。不同的基因编辑方法都是基于切割编码 TCR 的基因之一内的基因组，从而永久性地降低整个 TCR 复合物的表达。虽然是一种优雅的方法，但由于潜在的产品安全问题，这种剪刀策略一直难以进入临床测试阶段——主要是确保在基因编辑过程中没有“脱靶”基因组切割 3 。或者，在 mRNA 水平上靶向基因表达不涉及切割基因组，并避免危及基因组完整性。为了实现这种 mRNA“编辑”，Celyad Oncology 采用了短发夹 RNA (shRNA)，这是一种几十年来用于敲低基因表达的方法 4 。该方法涉及使用具有与目标基因互补序列的 shRNA。换句话说，靶向 shRNA 可以通过干扰 mRNA 而不是切割基因组 5 来特异性降低所需蛋白质（如 TCR 复合物）的水平。其中的核心是一体化载体方法。只需一步，将单一试剂（载体）引入健康供体 T 细胞，即可同时产生 T 细胞中的所有元素，这些元素可以将 T 细胞重定向到肿瘤（CAR）、消除 TCR（shRNA）并提供一个手柄，使修饰的细胞可以在制造过程中富集（标记物）。同种异体 CAR T 细胞平台中的 shRNA CD3z 亚基为 TCR 提供主要信号功率，从而激活和参与 T 细胞杀伤能力。通过选择最佳 shRNA 和工艺开发，靶向 CD3z 可使原代 T 细胞上的 TCR 持续高水平敲低，达到与基因编辑 CD3z 基因时相同的水平（图 1A）。从功能上讲，这与这些细胞无法对有丝分裂刺激（又称 TCR 驱动的 T 细胞活化；图 1B）作出反应以及当这些细胞被注入黄金标准体内测试模型时相应没有毒性有关（图 2A、B）。有趣的是，shRNA 靶向 T 细胞的持久性比 CRISPR-Cas9 基因的持久性要长得多