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SARS-CoV-2 前导序列和 NSP1 的关键特征是病毒逃避 NSP1 介导的抑制所必需的
SARS-CoV-2 是当前全球大流行的罪魁祸首，它必须克服所有病毒都面临的难题。为了实现自身的复制和传播，它同时依赖和破坏细胞机制。在感染的早期阶段，SARS-CoV-2 表达病毒非结构蛋白 1 (NSP1)，它通过阻断核糖体上的 mRNA 进入通道来抑制宿主翻译；这会干扰细胞 mRNA 与核糖体的结合。另一方面，病毒 mRNA 克服了这种阻断。我们表明 NSP1 增强了含有 SARS-CoV-2 前导序列的 mRNA 的表达。病毒前导序列中的第一个茎环 (SL1) 对于这种增强机制既必要又充分。我们的分析确定了 SL1 内的特定残基（位置 15、19 和 20 处的三个胞嘧啶残基）和 NSP1 内的另一个残基（R124），它们是病毒逃避所必需的，因此可能成为有希望的药物靶点。我们利用反义寡核苷酸 (ASO) 靶向 SL1，以有效且特异性地下调 SARS-CoV-2 mRNA。此外，我们使用 BioID 对 NSP1 的功能性相互作用组进行了分析，并确定了抗病毒防御途径的组成部分。因此，我们的分析表明 NSP1 抑制宿主基因表达同时增强病毒 RNA 表达的机制。该分析有助于调和文献中关于病毒避免 NSP1 沉默的机制的相互矛盾的报道。
亚马逊农村地区使用的传统家庭饮用水处理方法的表现
多囊卵巢综合征（PCOS）是最常见的内分泌疾病，影响了全球多达15％的生殖年龄妇女（1）。这种高度遗传，复杂的遗传疾病的特征是生殖和代谢异常的可变星座，导致了年轻女性中最多的不孕症和2型糖尿病（T2D）的大多数病例（1）。Clinically, the National Institutes of Health (NIH) criteria ( 2 ) and the Rotterdam criteria ( 3 , 4 ), the commonly used diagnostic criteria for PCOS, are based on the presence of at least two of three phenotypes: hyperandrogenism (HA), chronic oligo/anovulation or ovulatory dysfunction (OD), and polycystic ovarian morphology (PCOM) ( 2 – 4）。值得注意的是，目前在2023年发表的鹿特丹标准中描述了PCOS患者的选择，该标准还包括升高的睾丸激素和免费睾丸激素水平，除了先前引用的标准外。尽管PCOS的诊断标准中存在这些大量的病毒和显着进步，但考虑到PCOS病因的基本机制仍然很少了解，PCOS的患病率仍然上升（1）。除了影响生育能力之外，患有PCOS的个体的可能性升高了肥胖，胰岛素抵抗和代谢性疾病的可能性升高，所有这些都与线粒体功能障碍相互联系（6）。线粒体是负责能量产生的细胞器，是细胞ROS（活性氧）的主要来源，因此可能导致氧化应激损伤。到目前为止，PCOS患者中发现了33个相关的MTDNA突变。因此，线粒体生成的氧气已被认为是PCOS病因的关键因素（6）。有趣的是，PCOS患者已鉴定出mtDNA中的突变，即使它们在PCOS中的病因作用需要进一步研究，它们可能在PCOS病因和发病机理中起重要作用。在这些mtDNA突变中，大多数突变（在33个中的20个）被鉴定在D-Loop调节区域中，这表明
在空气 - 水接口上富集糖
理由。有机物在海面积聚。在本文中，我们提供了对持续性白泡沫中溶解糖的富集进行的首次定量评估，并将这种富集与涉及植物浮游生物的9天中型体验中的9天间中型实验中的海面微层层（SSML）进行比较。方法论。游离单糖，在轻度酸水解后确定总糖，并且将寡糖/多糖成分挖掘为挖掘，因为总和单糖之间的差异。结果。总糖水贡献了很大一部分的溶解有机碳（DOC），占海水中DOC的13％，在SSML中占27％，在泡沫中占31％。中值富集因子（EFS），计算为糖的浓度相对于SSML或SSML中的钠浓度与海水的浓度比，在SSML中为1.7至6.4，泡沫中的含量为1.7至6.4。基于EFS，木糖醇，甘露醇，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，木糖，木糖，富藻糖，鼠李糖和核糖的中位数比SSML更富集。讨论。糖的最大EFS与较高的叶绿素水平相吻合，表明在浮游植物盛开期间，海面富集糖表面富集。SSML上海泡沫中有机物的富集较高，表明表面活性有机化合物越来越丰富在持续的气泡膜表面上。这些发现有助于解释海洋有机物如何高度富集在海洋表面上的气泡产生的海洋喷雾剂中。
CRISPR/CAS9介导的突变铜转运蛋白ATP7B
Wilson病（WD）是一种基于ATP7B基因突变的单基因肝病，导致肝脏中铜（CU）的功能恶化。多余的Cu积聚在肝脏和大脑等各种器官中。WD患者显示出临床异质性，其范围从急性或慢性肝衰竭到神经系统症状。在大多数患者中用锌或螯合剂（例如D-苯胺胺）的终身治疗可以改善这种疾病的病程，但是在大部分患者中已经观察到了严重的副作用，例如神经系统恶化和肾脏毒性，因此不可避免地是肝移植。替代疗法选择是对ATP7B基因的遗传校正。最近在诊所中使用的新型基因治疗方法CRISPR/CAS9可能代表了合适的治疗机会。在这项研究中，我们首先使用CRISPR/CAS9基因编辑在人类细胞系中启动了人造ATP7B点突变，并通过额外使用单链寡核心DNA核苷酸（SSODN）来纠正该突变，从而模拟了VITRO中A WD点突变的基因校正。通过在唇彩后三天添加0.5 mm的Cu，可实现CRISPR/CAS9介导的ATP7B修复的细胞克隆的高收率（60％）。此外，使用结合了三个阻断突变的SSODN提高了修复效率。经过修复的细胞克隆在暴露于Cu浓度升高后对CU具有高抗性。我们的发现表明CRISPR/CAS9介导的ATP7B点突变的校正是可行的，并且可能有可能转移到诊所。
重新组合：使用同源重组的细菌基因工程
要进行重新组合，需要表达噬菌体重组系统的细菌菌株。噬菌体可以从其自己的启动子或异源调节启动子中表达。从其内源性噬菌体启动子中表达基因的基因赋予了紧密调控和坐标表达的优势，从而导致更高的重组频率。这是一个重要的优势，因为在许多情况下，高重组频率对于获得所需的重组至关重要。该单元的作者通常使用位于大肠杆菌染色体上的有缺陷的预言，最近将该预言的关键要素转移到了许多不同的质粒中（Thomason等，2005；另请参见评论）。在此预言系统中，噬菌体重组功能受到肉毒噬菌温度敏感的C I 857抑制剂的控制。在低温（30至34 C）下，重组基因会严重抑制，但是当细菌培养的温度转移到42 C时，它们会从P L启动子中高水平表达。在Datsenko和Wanner（2000）的质粒构建体中，重组基因位于质粒上，并从阿拉伯糖启动子表示。DATSENKO和WANNER质粒以及某些作者的质粒构建体具有DNA复制的温度敏感性。基于质粒的系统具有迁移率的优势 - 它们可以在不同的大肠杆菌菌株中转移到鼠伤寒沙门氏菌和其他革兰氏阴性细菌。但是，如果重新组合针对质量，则使用位于细菌染色体上的预言系统更容易。在诱导重组函数后，将修饰的DNA（DS）（DS）PCR产物或合成单链（SS）寡核苷酸（Oligo）引入到预防菌株中，通过电穿孔引入预防菌株中。通过选择或筛选存活电穿孔的细胞种群获得重新组件。一旦获得了所需的构建体，就可以通过另一个重组去除预言。或者，染色体上的工程等位基因可以通过P1转导将不同的宿主移动到另一个宿主中。具有温度敏感复制起源的质粒可能会因在适当温度下的生长而从重组菌株中丢失。
莱茵衣藻乙酰辅酶A羧化酶（CrACCase）的计算机基因组编辑鉴定和功能蛋白变化
莱茵衣藻中的乙酰辅酶a羧化酶（CrACCase）是一种编码三酰甘油（TAG）和脂质（油体）合成的基因。CrACCase基因研究很少，尚未进行过计算机或体内遗传改造。在本研究中，我们为基因组编辑，特别是CrACCase提供了生物信息学精确信息。本研究旨在构建sgRNA并预测CrACCase假定突变蛋白的功能区域。根据分子鉴定结果，可以对最佳的CrACCase（GeneBank XM_001703135）进行计算机遗传改造。本研究中最佳的潜在 sgRNA 构建体为 GCGTCTGCTCAATCACACGGCGG、TTGAGGTCGGAACTCCAGCGG 和 AGGCAATACCCTCAATTGGGTGG，效率值分别为 79.27%、68.25% 和 65.17%。获得的最佳寡核苷酸 sgRNA 具有一个带有 NGG 的原间隔区相邻基序 (PAM) 位点，尤其是 CGG 和 TGG 的形式。工程化的 CrACCase 基因突变的位置位于莱茵衣藻基因组的 XM_001703135.1:1089 区域，尤其是在负链中。预测 CrACCase 蛋白具有 ACC 的羧基转移酶亚基、假定 PCC 的羧基转移酶亚基、酵母乙酰辅酶 A 羧化酶的人源化羧基转移酶结构域和乙酰辅酶 A 羧化酶的结构。 CrACCase 基因中的移码突变的变化影响了残基 D:C 92、95、111 和 114 处配体-蛋白结合位点功能区的结构变化，这些位点是锌离子结合位点。这种结构变化导致 CrACCase 蛋白的功能发生变化。这种生物信息学信息对于将来对 CrACCase 进行体内基因组编辑非常重要，这样就可以获得具有最高 TAG 产量或最高生物柴油（油体）产量的突变体。分子生物学家和生物技术专家可以将对莱茵衣藻中 CrACCase 基因的操纵应用于脂质百分比最高的其他微藻生物，以增加未来的生物能源产量。
末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）
大肠杆菌DNA污染单位测试了N/A N/A 200 200 200 200 200个规范> 99％27,400 U/mg <5.0％释放<1.0％<1.0％释放no conversion <10拷贝蛋白质的来源：大肠杆菌菌株，一种带有来自calf thymus的calf thymus的大肠杆菌菌株，该菌株具有N-Calf thymus，该基因具有N-Calf Thymus，该基因具有N-末端式纤维质质质质质量。单位定义：1个单位定义为在37°C下1小时内将1 nmol DTTPS转换为酸不溶性材料所需的聚合酶量。分子量：82.6 KDA质量控制分析：使用2倍连续稀释方法测量单位活动。在1X反应缓冲液中制成酶的稀释液，并将其添加到50 µL含有寡做DT 20 MER DNA，1X反应缓冲液，0.25 mM COCL 2 3 H-DTTP和100 µM DTTP的反应中。在37°C下孵育10分钟，浸入冰上，并使用Sambrook和Russell的方法进行分析（3）。蛋白浓度（OD 280）由OD 280吸光度确定。物理纯度，然后进行银色染色检测。通过比较浓缩样品中污染物带的聚集质量与稀释样品中蛋白蛋白蛋白带的质量来评估纯度。单链核酸酶在含有放射性标记的单链DNA底物的50 µL反应中确定，在37°C下孵育4小时4小时。双链外切核酸酶在50 µL反应中确定，该反应含有放射性标记的双链DNA底物和10 µL的酶溶液在37°C下孵育4小时。双链核酸内切酶在50 µL反应中确定，该反应含有0.5 µg质粒DNA和10 µL的酶溶液在37°C下孵育4小时。大肠杆菌16S rDNA的污染是使用5 µL重复的酶溶液的重复样品，并在Taqman QPCR测定中筛选，以使用与16S RRNA locus相应的寡核苷酸引物，以存在污染的大肠杆菌基因组DNA。
ASHG 2023 全体会议摘要
使用 CRISPR/Cas9 进行神经遗传疾病的基因编辑面临难以穿过血脑屏障、渗透性有限和治疗窗口狭窄的挑战。虽然改良的腺相关病毒 (AAV) 克服了其中一些障碍，但由于 Cas9 蛋白的长期存在，它们的免疫原性和更高的脱靶效应风险限制了它们对人类神经遗传疾病的转化价值。为了解决这个问题，我们开发了一种创新的非病毒递送工具，使用与 Cas9 蛋白和 sgRNA 结合的化学修饰核糖核蛋白 (RNP) (cRNP-Cas9/sgRNA，cRNPcg)。由于其尺寸小 (12um)，cRNPcg 能够有效渗透到大脑中的神经元细胞中，而瞬时 Cas9 蛋白大大降低了脱靶效应的风险。我们在体外和体内测试了 cRNPcg 对 Angelman 综合征 (AS) 的疗效，这是一种由神经元和母体特异性 UBE3A 基因表达缺陷引起的神经发育障碍。父系染色体中 UBE3A 的抑制表达由父系表达的非编码 UBE3A 反义转录本 (UBE3A-ATS) 介导。通过反义寡核苷酸 (ASO) 灭活 UBE3A-ATS 在正在进行的 1/2 期临床试验中显示出积极的临床效果。然而，ASO 的短暂作用需要每月鞘内注射，这对作为标准临床治疗方法提出了挑战。我们设计的 cRNPcg 系统可选择性地灭活 Ube3a-ATS 表达，并可能通过单次治疗实现永久性治疗效果。使用 Ube3a-YFP 报告小鼠，我们观察到高基因编辑效率（>75% 靶向细胞）和广泛的脑渗透。我们给新生儿 (P1-2) 和 P21 AS Ube3 a m-/p+ 模型鞘内注射了 cRNPcg，观察到 Ube3a-ATS 显著降低，并且 Ube3a 重新激活至正常水平的 30%，遍及皮质、海马和小脑。因此，这种治疗显著改善了多个行为领域，包括运动功能、焦虑样行为、学习和记忆，并且还延长了成年 AS Ube3 a m-/p+ 小鼠化学诱发的肌阵挛和强直性癫痫发作的潜伏期。重要的是，我们没有观察到与 cRNPcg 相关的任何急性或慢性毒性。此外，我们发现 cRNPcg 有效地重新激活了 AS 患者 hIPSC 衍生的神经祖细胞中父系染色体上的 UBE3A 表达，这些神经祖细胞存在 15q11-q13 的大量母系缺失。总之，我们的结果表明，cRNPcg 是一个将 CRISPR/Cas9 基因编辑传递到大脑的创新平台，具有广泛的应用和治疗许多其他神经遗传疾病的潜力。
Codex DNA 与辉瑞签署早期合作与许可协议，进一步开发 Codex DNA 的新型酶促 DNA 合成技术
圣地亚哥 — 2021 年 1 月 10 日 — Codex DNA, Inc. (NASDAQ: DNAY) 是开发按需合成基因和 mRNA 的自动化解决方案的领导者，该公司今天宣布与辉瑞达成战略合作和许可协议，以获取和进一步开发 Codex DNA 的新型 EDS 技术，以供辉瑞应用于其基于 mRNA 的疫苗和其他生物制药产品。该交易的财务条款包括辉瑞向 Codex DNA 支付的预付款，以及近期可能获得的基于成功的技术里程碑付款。Codex DNA 还有资格根据实现与根据协议开发和许可的 Codex DNA 技术开发的任何产品相关的特定开发、监管和商业化目标而获得额外的里程碑付款。根据该协议，辉瑞可以提前获得定制的、最先进的 Codex DNA 技术，包括使用其专有的短寡核苷酸连接组装 (SOLA) EDS 技术。 SOLA EDS 是一种正在申请专利的可持续、可扩展且具有成本效益的研究方法，旨在显著缩短构建合成 DNA、RNA 和蛋白质的时间，从而可能使基于 mRNA 的疫苗、治疗剂、个性化药物和其他生物制药产品的研发更加高效和有效。SOLA EDS 旨在快速高效地合成高保真度的复杂基因，这些基因可能用于测试合成传染病变体的抗原性并高效地生产 mRNA 候选疫苗。Codex DNA 首席执行官 Todd R. Nelson 博士表示：“我们相信，这一战略性的早期准入合作和许可安排是对我们尖端 SOLA 酶法 DNA 合成技术的验证，并有可能加速疫苗和生物治疗研究和开发计划，造福人类。”Codex DNA 的全自动台式合成生物学解决方案可以加快疫苗开发和生物药物发现的时间表。其 SOLA EDS 技术将集成到未来的 Codex DNA 仪器中，使客户能够在满足其生命科学和合成生物学需求的端到端解决方案中开始使用数字 DNA 序列数据进行实验。该公司将继续提供其合成基因组目录，包括 SARS-CoV-2，用于研究发现单克隆抗体治疗、小分子疗法、诊断检测和针对特定变体的新疫苗。关于 Codex DNA Codex DNA 正在使科学家能够为人类面临的许多最大挑战创造新颖的合成生物学解决方案。作为行业标准 Gibson Assembly® 方法和首个商业自动化台式 DNA 和 mRNA 合成系统的发明者，Codex DNA 正在实现快速、准确、为众多下游市场提供 DNA 和 mRNA 的可重复书写。该公司屡获殊荣的 BioXp™ 系统整合、自动化和优化了
CRISPR 人工剪接因子。
剪接是去除前 mRNA 片段（称为内含子）同时将片段（称为外显子）连接在一起形成成熟 mRNA 的过程 1 。可变剪接是一种现象，其中基因的不同外显子片段剪接在一起形成具有不同序列的成熟 mRNA，大大扩展了单个基因编码的蛋白质库。可变剪接过程深深嵌入基因调控网络中，并控制 90% 以上的人类基因的基因异构体表达 2 。鉴于其普遍性，RNA 剪接失调与许多疾病有关也就不足为奇了 3 – 5 。RNA 测序是一种强大的工具，可用于“读取”转录组并识别不同细胞类型、条件和疾病中可变剪接的变化 2、5、6。但是，缺乏一种可扩展的工具来精确且可逆地“编写”可变剪接。尽管针对特定基因异构体进行降解的异构体特异性 RNAi 或异构体特异性 cDNA 过表达可用于扰乱异构体水平 7、8，但可能无法保持靶基因的整体表达水平。虽然剪接转换反义寡核苷酸 (ASO) 可有效扰乱剪接，甚至已进入临床试验 9，但它们的成本对于大规模研究而言过高，并且需要筛选许多设计以确定有效的靶序列。此外，由于 ASO 本质上是瞬时的，因此它们不适用于需要稳定或可诱导表达的用例。RNA 调节蛋白与异源 RNA 结合结构域的融合，例如 Pumilio/PUF、MS2 外壳蛋白 (MCP)、PP7 外壳蛋白 (PCP) 和 λ N，已经允许人工调节 RNA 过程 10 – 15。例如，通过工程化的 PUF 结构域将富含丝氨酸或富含甘氨酸的结构域束缚到外显子上，分别诱导它们的包含或排除12。然而，这些人工 RNA 效应分子需要蛋白质工程或在靶 RNA 中插入人工标签，并且依赖于短识别序列，这限制了靶向灵活性和特异性。遗传学和表观遗传学领域极大地受益于基于 RNA 引导的 DNA 靶向 CRISPR-Cas 系统的技术的爆炸式增长 16。我们，以及其他一些人，已经成功地实施了分子工具来修改目标 DNA 位点的遗传序列或表观遗传状态 17-25。CRISPR 介导的 DNA 水平基因编辑方法已被用于扰乱剪接（在剪接位点进行碱基编辑/插入缺失或切除整个外显子）19-21。然而，由于共享同一 DNA 片段的 DNA 顺式调控元件（例如转录因子结合位点）可能受到干扰，因此这些方法可能会产生混淆效应。此外，使用 CRISPR 介导的 DNA 缺失或突变方法很难促进外显子的插入。首次证明了使用 CRISPR 靶向 RNA 的激动人心的前景，即将最常用的 DNA 靶向 SpCas9 转化为 RNA 核酸酶“ RCas9 ”，并添加了 PAMmer - 一种寡核苷酸，当与靶 RNA 结合时，会模拟 SpCas9 结合所需的原型间隔区相邻基序 (PAM) 19 。虽然将 RCas9 靶向重复序列不需要 PAMmer 26 ，但重复序列仅占所有 RNA 顺式调控元件的一小部分。继 RCas9 首次报道之后，其他 CRISPR/Cas9 系统也被发现可在体外与单链 RNA 结合 27 、 28 ，但缺乏它们在哺乳动物细胞中体内 RNA 结合的证据。最近发现了来自细菌 CRISPR 系统的 RNA 引导的 RNA 核酸酶 29 – 31 。它们对哺乳动物细胞的适应不仅允许可编程的 RNA 降解 29、31、32，而且还可用于设计新功能，例如 RNA 序列编辑 30、活细胞 RNA 成像 32 和诊断 33。特别是，CasRx 是从 Ruminococcus flavefaciens 中分离出来的最近鉴定出的 IV-D 型 CRISPR-Cas 核糖核酸酶