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使用 CRISPR/Cas9 进行神经遗传疾病的基因编辑面临难以穿过血脑屏障、渗透性有限和治疗窗口狭窄的挑战。虽然改良的腺相关病毒 (AAV) 克服了其中一些障碍，但由于 Cas9 蛋白的长期存在，它们的免疫原性和更高的脱靶效应风险限制了它们对人类神经遗传疾病的转化价值。为了解决这个问题，我们开发了一种创新的非病毒递送工具，使用与 Cas9 蛋白和 sgRNA 结合的化学修饰核糖核蛋白 (RNP) (cRNP-Cas9/sgRNA，cRNPcg)。由于其尺寸小 (12um)，cRNPcg 能够有效渗透到大脑中的神经元细胞中，而瞬时 Cas9 蛋白大大降低了脱靶效应的风险。我们在体外和体内测试了 cRNPcg 对 Angelman 综合征 (AS) 的疗效，这是一种由神经元和母体特异性 UBE3A 基因表达缺陷引起的神经发育障碍。父系染色体中 UBE3A 的抑制表达由父系表达的非编码 UBE3A 反义转录本 (UBE3A-ATS) 介导。通过反义寡核苷酸 (ASO) 灭活 UBE3A-ATS 在正在进行的 1/2 期临床试验中显示出积极的临床效果。然而，ASO 的短暂作用需要每月鞘内注射，这对作为标准临床治疗方法提出了挑战。我们设计的 cRNPcg 系统可选择性地灭活 Ube3a-ATS 表达，并可能通过单次治疗实现永久性治疗效果。使用 Ube3a-YFP 报告小鼠，我们观察到高基因编辑效率（>75% 靶向细胞）和广泛的脑渗透。我们给新生儿 (P1-2) 和 P21 AS Ube3 a m-/p+ 模型鞘内注射了 cRNPcg，观察到 Ube3a-ATS 显著降低，并且 Ube3a 重新激活至正常水平的 30%，遍及皮质、海马和小脑。因此，这种治疗显著改善了多个行为领域，包括运动功能、焦虑样行为、学习和记忆，并且还延长了成年 AS Ube3 a m-/p+ 小鼠化学诱发的肌阵挛和强直性癫痫发作的潜伏期。重要的是，我们没有观察到与 cRNPcg 相关的任何急性或慢性毒性。此外，我们发现 cRNPcg 有效地重新激活了 AS 患者 hIPSC 衍生的神经祖细胞中父系染色体上的 UBE3A 表达，这些神经祖细胞存在 15q11-q13 的大量母系缺失。总之，我们的结果表明，cRNPcg 是一个将 CRISPR/Cas9 基因编辑传递到大脑的创新平台，具有广泛的应用和治疗许多其他神经遗传疾病的潜力。
ASHG 2023 全体会议摘要
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