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来自葡萄球菌基因组的强效 CRISPR-Cas9 抑制剂
抗 CRISPR (Acrs) 是抑制 CRISPR-Cas 酶的 RNA 引导 DNA 靶向活性的小蛋白。Acrs 由噬菌体和噬菌体衍生的细菌基因编码，可阻止 CRISPR 介导的噬菌体感染抑制，还可以阻止真核细胞中 CRISPR-Cas 介导的基因组编辑。为了确定能够抑制金黄色葡萄球菌 Cas9 (SauCas9)（最常用的基因组编辑蛋白化脓性链球菌 Cas9 (SpyCas9) 的替代品）的 Acrs，我们使用了自靶向 CRISPR 筛选和关联基因组搜索策略。在这里，我们描述了三种有效的 SauCas9 抑制剂，我们将其命名为 AcrIIA13、AcrIIA14 和 AcrIIA15。这些抑制剂具有一个保守的 N 端序列，该序列对于 DNA 切割抑制是可有可无的，并且具有不同的 C 端，在每种情况下，这些 C 端都是抑制 SauCas9 催化的 DNA 切割所必需的。在人类细胞中，我们观察到 AcrIIA13 对 SauCas9 诱导的基因组编辑具有强烈的抑制作用，而 AcrIIA14 和 AcrIIA15 则具有中等程度的抑制作用。我们还发现 AcrIIA13 – AcrIIA15 的保守 N 端结构域与这些 Acr 基因启动子中的反向重复序列结合，这与其预测的螺旋-转角-螺旋 DNA 结合结构一致。这些数据证明了一种有效的 Acr 发现策略，并确立了 AcrIIA13 – AcrIIA15 作为 SauCas9 的独特双功能抑制剂。
保守的DNA甲基转移酶：细菌表观遗传调节基本机制的窗口
越来越多的研究报告说，细菌DNA甲基化具有重要的功能，超出了其在限制性修饰系统中的作用，包括影响临床相关的表型，例如毒力，宿主定殖，孢子孢子，生物膜形成等。尽管有洞察力，但此类研究在很大程度上具有临时的性质，并且将从系统的策略中受益，从而实现微生物学界对细菌甲基瘤的联合功能表征。在这种意见中，我们建议高度保守的DNA甲基转移酶（MTases）代表了细菌表观基因组学研究的独特机会。这些MTases在细菌中很常见，跨越各种分类法，并且存在于多种人类病原体中。除了具有良好特征的核心DNA MTase，例如来自Vibrio Cholera，Salmonella Enterica，梭状芽胞杆菌艰难梭菌或化脓性链球菌的核心MTase，在许多人类病原体中也发现了多个高度保守的DNA MTase，其中包括属于Burkholderia属的人和阿科氏菌。我们讨论了为什么以及如何优先考虑这些MTase，以使社区范围内的综合方法进行功能基氏症研究。最终，我们讨论了一些高度保守的DNA MTases如何成为开发新型表观遗传抑制剂以用于生物医学应用的有希望的靶标。
合理设计 CRISPR-Cas9 核酸酶以减弱位置依赖性脱靶效应
摘要 化脓性链球菌的 RNA 引导 Cas9 核酸酶已成为一种重要的基因编辑工具。然而，其固有的脱靶活性是生物医学应用面临的主要挑战。与一些报道的专门针对单个结构域的工程策略不同，考虑到 Cas9 的特异性是由各个结构域协同决定的，我们合理地在酶的多个结构域中引入了多个氨基酸替换，以创建潜在的高保真度变体。我们还利用了我们之前推导的活化 Cas9 复合物结构的原子模型来指导新的修饰。这种方法已鉴定出具有增强的 DNA 切割特异性的 HSC1.2 Cas9 变体。虽然 HSC1.2 变体的特异性增强在体外切割试验中似乎与位置有关，但这种 Cas9 变体的脱靶 DNA 编辑频率远低于人类细胞中的野生型 Cas9。通过分子动力学模拟研究了导致观察到的位置依赖性效应的潜在机制。我们的发现为利用结构和动态信息开发具有高基因编辑特异性的 Cas9 样酶奠定了坚实的基础。
合理设计 CRISPR-Cas9 核酸酶以减弱位置依赖性脱靶效应
摘要 化脓性链球菌的 RNA 引导 Cas9 核酸酶已成为一种重要的基因编辑工具。然而，其固有的脱靶活性是生物医学应用面临的主要挑战。与一些报道的专门针对单个结构域的工程策略不同，考虑到 Cas9 的特异性是由各个结构域协同决定的，我们合理地在酶的多个结构域中引入了多个氨基酸替换，以创建潜在的高保真度变体。我们还利用了我们之前推导的活化 Cas9 复合物结构的原子模型来指导新的修饰。这种方法已鉴定出具有增强的 DNA 切割特异性的 HSC1.2 Cas9 变体。虽然 HSC1.2 变体的特异性增强在体外切割试验中似乎与位置有关，但这种 Cas9 变体的脱靶 DNA 编辑频率远低于人类细胞中的野生型 Cas9。通过分子动力学模拟研究了导致观察到的位置依赖性效应的潜在机制。我们的发现为利用结构和动态信息开发具有高基因编辑特异性的 Cas9 样酶奠定了坚实的基础。
双功能II型II-B CRISPR-CAS9
cas9链球菌（SPCAS9）通过启用由RNA引导的可编程DNA裂解，彻底改变了基因组编辑。但是，SPCAS9耐受DNA-RNA双链体中的不匹配，这可能导致有害的脱靶编辑。在这里，我们揭示了来自弗朗西斯氏菌（Francisella novicida）（FNCAS9）的Cas9具有独特的结构特征 - REC3夹具，其本质上是其内在的高保真DNA靶向。通过动力学和结构分析，我们表明REC3夹具与R环的PAM-DISTAL区域形成关键接触，从而在酶激活过程中施加了新的检查点。值得注意的是，F。Novicida编码了非规范的小CRIS相关RNA（Scarna），该RNA（Scarna）使FNCAS9能够抑制内源性细菌性脂蛋白基因，从而颠覆宿主的免疫检测。fncas9与Scarna的结构说明了部分R环的互补性如何阻碍REC3夹具对接并防止裂解以支持转录抑制。REC3夹具在II型-B CRISPR-CAS9系统中保存，指出了工程精确基因组编辑者或制定新型抗菌策略的潜在途径。这些发现揭示了FNCAS9高特异性和毒力的双重机制，对生物技术和治疗发展具有广泛的影响。
改进的CRISPR/CAS9工具用于梭状芽胞杆菌快速代谢工程
摘要：群集定期间隔短的短膜重复序列（CRISPR）/CAS（CRISPR相关蛋白质）9工具已经彻底改变了生物学 - 已经构建了几个高效的高效工具，这些工具已导致能够快速设计模型细菌，例如，Escherichia coli。但是，CRISPR/CAS9工具的使用已落后于非模型细菌，阻碍了工程工作。在这里，我们开发了改进的CRISPR/CAS9工具，以实现与工业相关细菌丙梭菌的有效快速代谢工程。以前的努力在C. actobutylicum中实施CRISPR/CAS9系统已受到缺乏严格控制的诱导系统以及大质粒的影响，从而阻碍了较低的转化效率。我们从艰难梭菌的木糖诱导系统控制下成功地将Cas9基因从链球菌诱导的系统控制到了基因组，然后我们表明，这导致了一个紧密控制的系统。然后，我们优化了编辑盒的长度，从而产生了一个小的编辑质粒，该质粒还包含UPP基因，以便使用UPP /5-氟尿嘧啶的反式系统快速失去质粒。我们使用该系统执行LDHA和PTB-BUK操纵子的单独和顺序缺失。
生物分子前景2024：
0730-1900 注册 - 全体会议休息室 0900-0935 大会欢迎词和开幕式 全体会议厅 2 0900-0935 大会欢迎词和开幕式 0935-1020 全体会议 1 - 人工智能会议室 全体会议厅 2 主席 Andy Hill 0935-1020 蛋白质语言模型正在学习做什么？ Sergey Ovchinnikov，美国麻省理工学院 1020-1030 会议变更 1030-1120 并行会议 1 - 主题演讲 KS1 - 生物信息学、计算生物学和组学 - 全体会议厅 2 主席 Bernie Pope 和 Megan Maher 1030-1100 主题演讲人 PI3K α 膜结合由 ras 增强且与改变的膜特性相关 Jane Allison，新西兰奥克兰大学 1100-1120 特邀演讲人将内源性分子转化为药物的综合方法 Peter Bond，新加坡生物信息学研究所 (A*STAR) KS2 - 疾病的分子基础 - 210 房间 主席 Justine Mintern 和 Jerome Le Nours 1030-1100 主题演讲人 Gpr43 介导的哮喘嗜酸性粒细胞调节 You-Me Kim，韩国科学技术高级研究所，韩国FAOBMB Kunio Yagi 讲座 1100-1120 特邀发言人 化脓性链球菌咽炎引发针对人类主要毒力因子的全身和粘膜免疫反应 Danika Hill，澳大利亚莫纳什大学
多重引导RNA表达系统及其对植物基因组工程的功效
摘要背景：化脓性链球菌 CRISPR 系统由 Cas9 内切酶 (Sp Cas9) 和含有靶标特异性序列的单链向导 RNA (gRNA) 组成。理论上，Sp Cas9 蛋白可以切割与基因组中结合的 gRNA 一样多的靶标位点。结果：我们引入了一种无 PCR 的多 gRNA 克隆系统来编辑植物基因组。该方法包括两个步骤：（1）在 pGRNA 载体中的 tRNA 和 gRNA 支架序列之间克隆两个单链寡核苷酸片段的退火产物，该片段的每条链上都含有互补的靶标结合序列；（2）使用 Golden Gate 组装方法将来自几个 pGRNA 载体的 tRNA-gRNA 单元与含有 Sp Cas9 表达盒的植物二元载体组装在一起。我们通过进行靶向深度测序验证了多重 gRNA 表达系统在野生烟草（Nicotiana attenuata）原生质体和转化植物中的编辑效率和模式。Sp Cas9-gRNA 的两次近端切割大大提高了编辑效率，并在两个切割位点之间诱导了较大的缺失。结论：这种多重 gRNA 表达系统能够高通量生产单个二元载体，并提高植物基因组编辑的效率。关键词：CRISPR-Cas9、金门组装、多重 gRNA、植物基因组编辑
系统研究多个 SV40 核定位信号融合对纯化 SpCas9 基因组编辑活性的影响
摘要：CRISPR-Cas9技术的出现彻底改变了基础和转化生物医学研究。为了使Cas9核酸酶发挥基因组编辑活性，通常将源自猿猴病毒40（SV40）T抗原的核定位信号（NLS）作为基因融合体安装，以引导细胞内的Cas9蛋白进入细胞核。值得注意的是，先前的研究表明，多个SV40 NLS融合可以提高Cas9衍生的基因组编辑和碱基编辑工具的靶向活性。此外，多NLS融合可以以组成性表达和直接递送Cas9-引导RNA核糖核蛋白（RNP）复合物的形式增加Cas9的细胞内活性。然而，NLS融合与细胞内Cas9活性之间的关系尚不完全清楚，包括活性对NLS融合数量或组织的依赖性。在本研究中，我们构建并纯化了一组在蛋白质的 N 端或 C 端含有 1 至 4 个 NLS 重复序列的化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 变体，并系统地分析了多 NLS 融合对 SpCas9 RNPs 活性的影响。我们发现，多 NLS 融合可以提高脂质转染或核转染 Cas9 RNPs 的细胞内活性。重要的是，多 NLS 融合可以增强 SpCas9 RNPs 在原代细胞、干细胞/祖细胞和小鼠胚胎中的基因组编辑活性。
白喉爆发发生的人...
白喉的孵育期通常为2-5天（范围1-10天）（3-5）。在伤口感染中，经常与其他皮肤病原体（如链球菌为甲虫或金黄色球菌）一起发现白喉梭菌（6）。皮肤伤口被毒二肠杆菌植入或感染，是严重呼吸衰落感染的潜在来源，在未经治疗时可能导致高死亡率（7）。可用的主要治疗方法是中和毒素的作用是马二毒素抗毒素，理想情况下应在Intial症状发作后的48小时内给药。然而，由于欧洲的需求较低，在过去的十年中，抗毒素抗毒素的生产，副产品和可利用性下降，导致欧洲许多国家的短缺（4、8、9）。世界卫生组织的目的是到2000年消除白喉；因此，在1970年代后期启动了全球免疫计划。因此，在许多国家，白喉病例大大减少（10，11）。全疫苗接种，通常需要> 3剂二骨毒素 - 辅助疫苗，可提供可靠的保护：87％针对有症状的疾病，93％抗死亡（5）。在欧洲，白喉主要影响到前往