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双 sgRNA 定向 CRISPR/Cas9 构建体，用于编辑有色柑橘类水果中果实特异性的 β -环化酶 2 基因
CRISPR/Cas9 基因组编辑是一种现代生物技术方法，用于改良植物品种，仅改变特定品种的一个或几个性状。然而，由于缺乏对关键基因的了解、幼苗期较长以及特定品种的整株植物难以再生，这种技术不能轻易用于改良柑橘果实的品质性状。在这里，我们介绍了一种基因组编辑方法，目的是生产果实中同时含有番茄红素和花青素的柑橘幼苗。我们的方法采用双单向导 RNA (sgRNA) 定向基因组编辑方法来敲除果实特异性的 β-环化酶 2 基因，该基因负责将番茄红素转化为 β-胡萝卜素。两个 sgRNA 同时靶向该基因以产生大量缺失，并在两个 sgRNA 靶标中诱导点突变。农杆菌 EHA105 菌株用于转化五种不同的花青素甜橙（属于 Tarocco 和 Sanguigno 品种组）和“Carrizo”枳橙（一种柑橘砧木）作为柑橘转化的模型。在目标区域测序的 58 个小植株中，86% 成功编辑。最常见的突变是缺失（从 -1 到 -74 个核苷酸）和插入（+1 个核苷酸）。此外，在六个小植株中发现了一个新事件，包括两个 sgRNA 之间区域的倒置。对于发生单个突变的 20 个小植株，我们排除了嵌合事件。小植株在营养组织中没有表现出改变的表型。据我们所知，这项工作是使用基因组编辑方法潜在改善柑橘水果品质性状的第一个例子。
sgRNA 的位点特异性和酶促交联可实现波长可选的光激活控制 CRISPR 基因编辑
化学交联能够快速识别 RNA-蛋白质和 RNA-核酸分子间和分子内相互作用。然而，目前尚无方法能够位点特异性和共价交联 RNA 内两个用户定义的位点。在这里，我们开发了 RNA-CLAMP，它能够位点特异性和酶促交联（夹紧）RNA 内两个选定的鸟嘌呤残基。分子内夹紧会破坏正常的 RNA 功能，而随后对交联剂进行光裂解会恢复活性。我们使用 RNA-CLAMP 通过光裂解交联剂夹紧 CRISPR-Cas9 基因编辑系统的单向导 RNA (sgRNA) 内的两个茎环，完全抑制编辑。可见光照射会裂解交联剂并以高时空分辨率恢复基因编辑。设计两种对不同波长的光有响应的光裂解接头，可以在哺乳动物细胞中实现基因编辑的多路复用光激活。这种光激活的 CRISPR-Cas9 基因编辑平台受益于无法检测的背景活动，提供激活波长的选择，并具有多路复用功能。
农杆菌和单个 Cas9-sgRNA 转录系统介导的多年生黑麦草高效基因编辑
基因组编辑技术为多年生黑麦草（一种全球重要的牧草和草坪草种）的遗传改良提供了强有力的工具。关于多年生黑麦草基因编辑的唯一出版物使用基因枪进行植物转化，并使用基于双启动子的 CRISPR/Cas9 系统进行编辑。然而，它们的编辑效率很低（5.9% 或只产生了一株基因编辑植物）。为了测试玉米泛素 1 (ZmUbi1) 启动子在多年生黑麦草基因编辑中的适用性，我们制作了 ZmUbi1 启动子：RUBY 转基因植物。我们观察到 ZmUbi1 启动子在芽再生之前的愈伤组织中活跃，这表明该启动子适用于多年生黑麦草中的 Cas9 和 sgRNA 表达，以高效生产双等位基因突变植物。然后，我们使用 ZmUbi1 启动子来控制多年生黑麦草中的 Cas9 和 sgRNA 表达。Cas9 和 sgRNA 序列之间的核酶切割靶位点允许在转录后产生功能性 Cas9 mRNA 和 sgRNA。使用农杆菌进行遗传转化，我们观察到在多年生黑麦草中编辑 PHYTOENE DESATURASE 基因的效率为 29%。DNA 测序分析表明，大多数 pds 植物含有双等位基因突变。这些结果表明，由 ZmUbi1 启动子控制的单个 Cas9 和 sgRNA 转录单元的表达为产生多年生黑麦草的双等位基因突变体提供了一种高效的系统，并且也适用于其他相关草种。
基于双sgRNA的金针菇CRISPR/Cas9基因组编辑系统的建立
1 农业部农业环境微生物工程重点实验室，南京农业大学生命科学学院微生物学系，南京 210095，江苏；sheltonliu@foxmail.com (XL)；10318127@njau.edu.cn (JD)；10317128@njau.edu.cn (JL)；2020116058@stu.njau.edu.cn (LT)；2020816130@stu.njau.edu.cn (HQ)；wt1170450810@hotmail.com (TW)；2021816129@stu.njau.edu.cn (FG)；jingzhu@njau.edu.cn (JZ)；shiliang@njau.edu.cn (LS)；aljiang@njau.edu.cn (AJ)； yuhans@njau.edu.cn (HY); mwzhao@njau.edu.cn (MZ) 2 南京农业大学三亚学院，三亚 572025，中国 3 贵州省科学院生物研究所，贵阳 550009，中国 * 通讯地址：angren@njau.edu.cn；电话/传真：+86-25-84395602 † 这些作者对本文的贡献相同。
考虑 tracrRNA 序列中的细微变化可改善 CRISPR 筛选的 sgRNA 活性预测
CRISPR 技术是研究基因组功能的强大工具。为了帮助从众多可能的选项中挑选出对目标靶标具有最大功效的 sgRNA，几个研究小组开发了预测 sgRNA 靶向活性的模型。尽管多种 tracrRNA 变体通常用于筛选，但现有的模型在提名 sgRNA 时都没有考虑到这一特征。在这里，我们开发了一个靶向模型，规则集 3，它可以对多种 tracrRNA 变体做出最佳预测。我们在一个新的 sgRNA 数据集上验证了规则集 3，该数据集涵盖了必需和非必需基因，与之前的预测模型相比有显著的改进。通过分析 tracrRNA 变体之间 sgRNA 活性的差异，我们表明 Pol III 转录终止是 sgRNA 活性的重要决定因素。我们期望这些结果能够提高 CRISPR 筛选的性能，并为未来对 tracrRNA 工程和 sgRNA 建模的研究提供参考。
从可解释的人工智能中了解 CRISPR-Cas9 sgRNA 效率的量子生物学见解
1 计算和预测生物学，生物科学，橡树岭国家实验室，美国田纳西州橡树岭 2 田纳西大学诺克斯维尔分校布雷迪森跨学科研究与研究生教育中心，美国田纳西州橡树岭 3 合成生物学，橡树岭国家实验室，美国田纳西州橡树岭 4 计算科学与工程，橡树岭国家实验室，美国田纳西州橡树岭 本稿件由 UT-Battelle, LLC 根据与美国能源部签订的合同编号 DE-AC05- 00OR22725 撰写。美国政府保留；并且出版商在接受文章发表时，承认美国政府保留非独占的、已付费的、不可撤销的全球许可，可以为美国政府的目的出版或复制本稿件的已出版形式，或允许他人这样做。能源部将根据能源部公共访问计划 ( http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan ) 向公众开放这些联邦资助研究的成果。摘要：CRISPR-Cas9 工具已经彻底改变了实验室的基因操作能力。经验法则仅针对少数模型生物建立，而 sgRNA 效率的机制基础仍然知之甚少。这项工作建立了一个使用量子化学张量生成的新特征集和新公共资源，用于解释和预测 sgRNA 效率。sgRNA 效率的特征工程是使用可解释的人工智能模型；迭代随机森林 (iRF) 执行的。通过对大肠杆菌 sgRNA 的位置特异性序列的定量属性进行编码，我们确定了细菌物种中 sgRNA 设计的重要性状。此外，我们还表明，将位置编码扩展到碱基对、二聚体、三聚体和四聚体序列的量子描述符可以捕获目标 DNA 局部和邻近核苷酸中复杂的相互作用。这些特征凸显了大肠杆菌和智人基因组之间 CRISPR-Cas9 sgRNA 动力学的差异。这些新颖的 sgRNA 编码极大地增强了我们对 CRISPR-Cas9 机制中涉及的复杂量子生物过程的理解。
使用新型 Lb Cas12a 变体对大麦进行高效基因组编辑以及 sgRNA 结构的影响 Tom Lawrenson、Alison Hinchliffe、Macarena
CRISPR、Cas12a、CPF1、大麦、诱变、单子叶植物、基因组编辑摘要我们报告了首次成功、高效使用大麦中的 Lb Cas12a，并描述了两种新型 Cas12a 变体的开发和应用。总共我们使用二十种不同的指南比较了五种编码序列 (CDS) 变体，包括两种新型变体和两种指南架构，针对 5 种不同的靶基因。我们发现不同 CDS 版本 (0-87%) 和指南架构 (0-70%) 之间的编辑效率存在很大差异，并且表明我们的两个新型 CDS 版本在该物种的测试中大大优于其他版本。我们展示了产生的突变的遗传性。我们的研究结果强调了优化单个物种的 CRISPR 系统的重要性，并可能有助于在其他单子叶植物中使用 Lb Cas12a。正文 毛螺菌科细菌 Cas12a (Lb Cas12a) 可能是继化脓性链球菌 Cas9 (Sp Cas9) 之后植物基因组编辑中第二广泛使用的可编程核酸酶，并且具有一些潜在优势。首先，由于其对 TTTV PAM 的要求与 NGG 的 Sp Cas9 要求不同，它可用于 GC 沙漠，而 GC 沙漠通常存在于内含子、UTR 和启动子区域中。其次，Lb Cas12a 通常比 Sp Cas9 产生更大的缺失，这可能在缺失研究中有用。第三，虽然 Sp Cas9 在靶标的 PAM 近端切割产生平端，但 Lb Cas12a 在 PAM 远端区域切割产生粘端；这两个特征可能解释了使用 Lb Cas12a 实现的基因靶向发生率更高 (Wolter 和 Puchta，2019)。已知在植物中起作用的三种版本的 Lb Cas12a 针对一个大麦靶标进行了测试。首先，是水稻优化的编码序列 (CDS) (Os Cas12a) (Tang et al., 2017)；其次是人类优化的 CDS (Hs Cas12a)，在双子叶植物中具有功能 (Bernabé-Orts et al., 2019)；第三是拟南芥优化的 CDS，包含 D156R“耐高温”突变 (tt At Cas12a) (Schindele and Puchta, 2020)。我们还创建了两个新版本，携带 D156R 突变的 Hs Cas12a (tt Hs Cas12a) 和携带 8 个内含子的 tt At Cas12 (tt At Cas12+int)。这些内含子之前曾显著提高过 Sp Cas9 的效率（Grutzner 2021），因此我们使用相同的在线工具（NetGene2 - 2.42 - Services - DTU Health Tech）在我们的 tt At Cas12+int 设计中为拟南芥选项获得了较高的剪接置信度。
一个时空可解释的模型，用于预测 sgRNA 的...
摘要背景：为避免脱靶效应，越来越多具有更高特异性的Cas9变体被开发出来，这带来了大量的实验数据。传统的机器学习在这些数据集上表现不佳，而基于深度学习的方法往往缺乏可解释性，这使得研究人员不得不在准确性和可解释性之间做出权衡。有必要开发一种方法，不仅在性能上可以与基于深度学习的方法相匹配，而且具有良好的可解释性，可以与传统的机器学习方法相媲美。结果：为了克服这些问题，我们提出了一种基于深度学习的本质上可解释的方法来预测靶向活性，称为AttCRISPR。AttCRISPR的优势在于使用集成学习策略将可用的基于编码的方法和基于嵌入的方法堆叠在一起，具有很强的可解释性。与使用WT-SpCas9，eSpCas9（1.1），SpCas9-HF1数据集的现有技术方法相比，AttCRISPR在几个公共数据集上分别可以达到0.872、0.867、0.867的平均Spearman值，优于这些方法。此外，得益于两个注意模块——一个是空间注意模块，一个是时间注意模块，AttCRISPR具有良好的可解释性。通过这些模块，我们可以在全局和局部层面理解AttCRISPR做出的决策，而无需其他事后解释技术。结论：通过训练后的模型，我们在全局层面揭示了每个数据集中sgRNA（短向导RNA）序列上每个位置依赖性核苷酸的偏好。而在局部层面，我们证明了AttCRISPR的可解释性可用于指导研究人员设计具有更高活性的sgRNA。
e CIENT CRISPR/CAS9介导的合并-sgrnas ...
结果：在一个实验中靶向多个基因，通过优化的CRISPR/CAS9系统将112个与植物发育相关的基因拆除。我们优化了合并的SGRNA组装方法的关键步骤，该方法通过该方法将116个SGRNA合并为4组（每组由29个SGRNA组成）。每组SGRNA都是在一个PCR反应中编译的，随后经过一轮矢量构建，转化，SGRNA鉴定以及一轮遗传转化。通过遗传转化介导的农杆菌，我们成功地产生了800多个植物。 对于突变体识别，已经使用了下一代测序技术，结果表明所有产生的植物都是阳性的，并且涵盖了所有靶向基因。 有趣的是，在所有转基因植物中，85％通过遗传转化介导的农杆菌，我们成功地产生了800多个植物。对于突变体识别，已经使用了下一代测序技术，结果表明所有产生的植物都是阳性的，并且涵盖了所有靶向基因。有趣的是，在所有转基因植物中，85％