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将 dsDNA 与 ssDNA Oligo 和 NEBuilder HiFi DNA 组装连接起来，创建 sgRNA-Cas9 表达载体
摘要 本应用说明展示了将 sgRNA 序列插入 9.5 kb 载体进行靶向 DNA 组装的便利性。与必须合成并重新退火两个寡核苷酸的传统克隆方法不同，此新方案提供了一种简单的方法来设计寡核苷酸并将其与所需载体组装。NEBuilder HiFi DNA 组装主混合物比传统方法有了显著的改进，特别是在节省时间、易于使用和成本方面。
将 dsDNA 与 ssDNA Oligo 和 NEBuilder HiFi DNA 组装连接起来，创建 sgRNA-Cas9 表达载体
摘要 本应用说明展示了将 sgRNA 序列插入 9.5 kb 载体进行靶向 DNA 组装的便利性。与必须合成并重新退火两个寡核苷酸的传统克隆方法不同，此新方案提供了一种简单的方法来设计寡核苷酸并将其与所需载体组装。NEBuilder HiFi DNA 组装主混合物比传统方法有了显著的改进，特别是在节省时间、易于使用和成本方面。
通过预复合的 CRISPR-Cas9/sgRNA 核糖核蛋白避开细胞抑制 RNA，实现高效的 ssODN 介导靶向
结合 CRISPR-Cas9 技术和单链寡脱氧核苷酸 (ssODN)，可以在诱导性多能干细胞 (iPSC) 中的目标基因组位点引入特定的单核苷酸改变；然而，与缺失诱导相比，ssODN 敲入频率较低。尽管已报道了几种 Cas9 转导方法，但是 CRISPR-Cas9 核酸酶在哺乳动物细胞中的生化行为仍有待探索。在这里，我们研究了影响 Cas9 体外裂解活性的内在细胞因素。我们发现细胞内 RNA（而不是 DNA 或蛋白质部分）会抑制 Cas9 与单向导 RNA (sgRNA) 结合并降低酶活性。为了防止这种情况，与 Cas9 过表达方法相比，在递送到细胞之前预复合 Cas9 和 sgRNA 可产生更高的基因组编辑活性。通过优化预复合核糖核蛋白和ssODN的电穿孔参数，我们实现了高达70%的单核苷酸校正效率和高达40%的loxP插入效率。最后，我们可以用C2等位基因替换HLA-C1等位基因，以生成组织相容性白细胞抗原定制编辑的iPSC。
通过优化SGRNA ...
摘要aflysam/crispra系统最近已成为果蝇果蝇（Drosophila Melanogaster）的功能性研究的强大工具。该系统包括GAL4/UAS驱动的DCAS9激活剂和U6促进器控制的SGRNA。建立了超过其他组合的DCAS9激活剂，以进一步提高靶向激活剂的效率，我们系统地优化了SGRNA的参数。有趣的是，发现最有效的SGRNA在转录起始位点（TSS）上游的-150bp到-450bp的区域积累，并且激活效率显示与SGRNA靶向序列的GC含量的正阳性相关性很强。此外，目标区域主要是GC含量，因为SGRNA的靶向区域超过-600BP，即使含有75％的GC，TSS的SGRNA都会降低效率。令人惊讶的是，当将靶向sgrNA的活性与DNA链的活性进行比较时，靶向非模板链的SGRNA靶向均优于互补的模板链，无论是在细胞和体内。总而言之，我们定义了SGRNA设计的标准，这将极大地促进CRISPRA在功能奖励研究中的应用。
引文：Fan, R., Chai, Z., Xing, S., Chen, K., Qiu, F., Chai, T., Qiu, JL, Zhang, Z., Zhang, H., and Gao, C. (2020). 缩短 sgRNA-DNA 介
2018 ；Chen 等人，2017 ；Kleinstiver 等人，2016 ；Lee 等人，2018 ；Slaymaker 等人，2016）。增加和减少 sgRNA-DNA 界面的长度都会显著降低五种 Cas9 变体中的四种的编辑效率，Sniper-Cas9 是个例外（Lee et al., 2018）。但这种影响的基础尚不清楚。最近，Fu 等人观察到与靶标存在大量错配的 sgRNA 能够引导 SpCas9 切口双链 DNA（Fu et al., 2019）。同样，Szczelkun 等人描述了截短的 sgRNA（互补区为 ∆ 7 nt）与嗜热链球菌 Cas9 (StCas9) 结合导致缺口分子的积累 ( Szczelkun 等人，2014 )。这些观察结果表明，截短/延长的间隔区衍生片段对核酸酶的 HNH 和 RuvC 切割域施加了不同程度的影响，使得它们在某些情况下会切开目标 DNA，而不是将其切割。在这里，我们试图检验这一假设。
通过GFP-Reporter测定法恢复单切SGRNA的敏感且可靠的评估
大多数Duchenne肌肉营养不良（DMD）病例是由一个或多个外显子的删除或重复引起的，这些外显子破坏了DMD mRNA的阅读框架。恢复阅读框允许产生部分功能性肌营养不良蛋白，并导致症状不太严重。反义寡核苷酸介导的外显子跳过已被批准用于DMD，但是该策略需要重复治疗。crispr/cas9还可以恢复室内读取框架。尽管最近的体内研究表明单切换/外显子跳过策略的功效，但缺乏找到特定突变的最有效的单切SGRNA的方法。在这里，我们表明插入/删除（Indel）产生效率和Indel曲线都有助于读取框架恢复单切SGRNA的效率，因此只检查Indel频率的测定无法找到最佳的SGRNA。因此，我们开发了一种GFP重复蛋白测定法，以评估单切性效率，并报告了这两个方面的综合效应。我们表明，GFP-Reporter分析可以可靠地预测肌细胞中SGRNA的性能。此GFP-报告基因测定法可以有效，可靠地找到最有效的单切SGRNA来恢复肌营养不良蛋白的表达。
合成SGRNA套件 - Net
请访问Synthego.com/Resources找到建议的转染协议。步骤4：分析敲除效率合成的推断CRISPR编辑（ICE）是一种免费的在线工具，可简单地使用Sanger序列数据对基因组编辑进行易于定量评估。该软件比较了从编辑和未编辑的细胞库中分离出的基因组DNA产生的扩增子的序列轨迹。该工具可在Ice.synthego.com上找到。基因组DNA制备，冰分析和克隆分离的方案可在Synthego.com/resources上获得。
CRISPR-Cas9 介导的精准微生物基因组编辑，借助目标错配的 sgRNA
CRISPR-Cas9 系统彻底改变了基因组编辑。CRISPR-Cas9 由单分子向导 RNA (sgRNA) 和蛋白质 Cas9 核酸酶组成，后者可识别特定靶序列和原型间隔区相邻基序 (PAM) 序列，然后切割目标 DNA 序列。该 CRISPR-Cas9 系统已被用作有效的负选择工具，用于在位点特异性诱变过程中切割未编辑或未改变的靶 DNA，从而获得具有所需突变的微生物细胞。本研究旨在调查 CRISPR-Cas9 系统在细菌体内寡核苷酸定向诱变中的基因组编辑效率。该系统成功地在大肠杆菌的 galK 中引入了 2 到 4 个碱基的突变，编辑效率很高 (81% − 86%)。然而，单点突变（T504A 或 C578A）很少引入，并且编辑效率非常低（<3％），这可能是由于错配耐受性所致。为了解决这个问题，我们在 sgRNA 序列中设计了一个或两个碱基的错配，以识别大肠杆菌中 galK 的靶序列。使用单碱基错配的 sgRNA，在 36％−95％ 的负向选择的大肠杆菌细胞中成功引入了单点核苷酸突变（galK 基因中的 T504A 或 C578A）。通过使用错配的 sgRNA 的全基因组单碱基编辑实验，随机选择了 16 个靶标。因此，在 48 个所需的单碱基突变中，使用错配的 sgRNA 成功编辑了 25 个单碱基。最后，为微生物基因组中的单核苷酸编辑提供了适用的靶标错配 sgRNA 设计规则。
有效地递送活性Cas9蛋白和靶标特异性SGRNA到广泛的细胞类型
最后，在悬浮液中生长的Jurkat细胞中，评估了吉赛克的敲除生理相关的内源基因。敲除靶向的CD81，该CD81编码在许多哺乳动物细胞中表达的细胞表面蛋白，并与丙型肝炎，HIV和流感发病机理有关。jurkat细胞用Cas9和CD81特异性SGRNA的表达质粒共转染，或用靶向CD81的Cas9 -Sgrna RNP复合物预加载的gesiles处理。通过抗体标记评估CD81的基因敲除效率，然后进行流式细胞仪分析（图4）。基于质粒的递送导致效率非常低。只有7％的细胞损失CD81表达。相反，吉塞拉（Gesicles）具有很高的效率，其中76％的Jurkat细胞缺乏可检测到的CD81水平。因此，吉质的表现优于基于质粒的技术，具有在难以转化细胞中有效靶向内源基因的能力。
sgrnas-correates-with-...
CRISPR/CAS9基因组编辑用于破坏HeLa细胞中的CXCR4基因座。CXCR4编码与CXCL12趋化因子相互作用的细胞表面趋化因子受体，并在免疫系统中起重要作用。在本实验中，使用指南IT SGRNA筛选试剂盒测试了针对CXCR4基因座的四个不同的SGRNA。简要地，使用指南SGRNA在体外转录试剂盒中合成了针对CXCR4基因的SGRNA。一个包含SGRNA靶序列的PCR片段与重组Cas9蛋白和每个SGRNA混合。通过琼脂糖凝胶电泳分析裂解反应。光密度法（Cong等，2013）表明SGRNA3的裂解效率最低（图2）。