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CRISPR/Cas技术是一种简单、快速且极其有效的基因编辑方法。为了描述该技术的原理和医学应用，在 Pubmed、SciELO、Google Scholar 和 Cochrane Library 中进行了文献综述，描述词为“基因编辑”、“基因组编辑”、“CRISPR-Cas 系统”和“CRISPR 相关蛋白 9”。 CRISPR/Cas9 系统包含 Cas 内切酶和两种 RNA。 Cas将入侵的噬菌体DNA切成片段，作为间隔物整合到CRISPR序列中。然后，CRISPR 序列被转录生成 crRNA 和 tracrRNA，它们形成双螺旋 RNA 结构，招募 Cas 进行切割。该系统通过质粒、RNA或核糖核蛋白引入细胞内部。核定位序列允许 CRISPR/Cas9 进入细胞核。 CRISPR/Cas9技术是一种高效的精准基因编辑工具，对科学研究有着重大影响。
IPSC中使用CRISPR的高效精确基因组编辑方法
基因组编辑是生物技术领域中开发的最强大的工具之一。改变生物体的基因组的能力使科学家能够在更复杂的系统中研究挑战性的进化和药用问题1。全基因组关联研究（GWAS）产生了大量的单核苷酸多态性（SNP），与疾病风险增加相关的遗传变异2。基因编辑允许生产含有SNP的基因工程的同源线，这些细胞可能说明了这种遗传突变如何引起疾病。编辑水平从理论上简单的基因敲除到更复杂的编辑，例如完整的基因插入或点突变。尽管基因组编辑技术已经快速提高，但仍未解决的几个挑战3 - 5。群集定期间隔短的短质体重复序列（CRISPR）已成为动植物模型中基因组编辑的首选方法6。当前方法通常使用核酸酶变体Cas9和cas12a 6。CRISPR -CAS9和-CAS12A系统与指南RNA（GRNA）相互作用，该导向RNA（GRNA）由两个段组成：CRISPR RNA（CRRNA）指定基因组靶点位点和反式激活CRISPR RNA（TRACRRNA），这些crispr rna（tracrRNA）直接与CAS与CAS核蛋白结合以形成核糖核蛋白蛋白（RNP）7。与先前的基因改变技术相比，创新的CRISPR-CAS基因编辑技术更简单，更负担得起配置，从而导致了广泛的利用率2、8、9。我们假设我们可以通过抑制p53激活，从而提高编辑效率来改善细胞恢复。然而，尽管CRISPR-CAS编辑系统取得了重大进展，但迫切需要进一步的优化以提高效率和成功编辑的百分比，尤其是当多种风险变体与感兴趣的基因相关联时，就需要通过敲击多个遗传修饰的多种SNP产生具有不同SNP的多线。在这项研究中，我们旨在开发一种高效且易于适应的基因编辑方案，以克服目前限制细胞系中点突变效率的障碍。由于与CRISPR和单细胞克隆10相关的双链染色体断裂而引起的明显细胞死亡。另一方面，据报道，抑制相关激酶（岩石）或p53途径可通过预防细胞死亡8来提高编辑效率8。
CRISPR 技术：犹太人的法律视角
CRISPR 技术有两个基本生物学组成部分（图 1）。2 第一组组成部分是称为 CRISPR 相关蛋白 (Cas) 的蛋白质，其功能如同分子剪刀，可启动 DNA 的双链断裂。第二组组成部分是向导 RNA，由两部分组成：CRISPR RNA (crRNA) 和反式激活 CRISPR RNA (tracrRNA)。向导 RNA 会瞄准 DNA 上 Cas 进行断裂的确切位点。CRISPR 介导的编辑机制主要有三种类型，可产生基因操作。首先，CRISPR 可在 DNA 中造成单次切割，破坏原始 DNA 序列并导致基因失活。其次，可以使用两个向导 RNA 删除较大的 DNA 片段。在每个 DNA 位点进行切割后，细胞修复过程会将剩余 DNA 片段的不同末端连接起来。第三，可以将 DNA 模板添加到 CRISPR 机制中，使细胞能够纠正基因，甚至插入新基因。
基因组编辑技术，机制和改善治疗性植物化学物质的产生：机会和前景
图1各种基因组编辑工具。（a）锌指核酸酶（ZFN）充当二聚体。每个单体由DNA结合结构域和核酸酶结构域组成。每个DNA结合结构域由3 - 6个锌指重复序列组成，识别9 - 18个核苷酸。核酸酶结构域由II型限制性核酸内切酶FOK1组成。（b）转录激活剂类似核酸酶（Talens）：这些是类似于ZFN的二聚体酶。每个亚基由DNA结合结构域（高度保守的33 - 34个氨基酸序列）和FOK1核酸酶结构域组成。（c）CRISPR/CAS9：CAS9核酸内切酶由SGRNA（单引导RNA：CRRNA和TRACRRNA）引导，用于靶特定裂解。二十个核苷酸识别位点存在于原始基序（PAM）的上游（来自Arora＆Narula，2017年）。版权所有©2017 Arora和Narula。这是根据Creative Commons归因许可（CC BY）的条款分发的开放访问文章。
CRISPER-CAS系统及其应用
摘要 CRISPR-Cas 专注于许多细菌和几乎所有古细菌的适应性免疫系统。它的发现证明了它是一种简单的工具，并且在许多方面都有效，例如转录激活因子。它可用于在单个事件中同时添加所需等位基因并去除不需要的等位基因。目前，CRISPR-Cas 已成为一种工程工具，用于控制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、酿酒酵母等许多生物体的遗传改造。CRISPR-Cas9 系统因其易于构建的实验室和针对多个基因组位点而彻底改变了基因组编辑领域。Cas9 酶已被用作医学研究领域中定向基因编辑的流行工具。它可以用作各种无法治愈的遗传疾病的有效基因治疗方法。它主要用于微生物适应性免疫系统、基因调控、功能基因组学、基因组编辑、关键词：基因组编辑、CRISPR-Cas 收到日期 2020 年 5 月 21 日 修订日期 2020 年 6 月 15 日 接受日期 2020 年 7 月 23 日 简介 1970 年，重组 DNA 技术的发展标志着生物学新时代的开始。分子生物学家获得了操纵生命“DNA”蓝图的能力，从而可以研究基因和利用新型药物。它为我们提供了一种通过在目标位点插入或删除基因来获得基因组中所需变化的方法。CRISPER 就是这样一种新型分子工具的发展。成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPER)/CRISPER 相关 (Cas) 系统存在于许多细菌和几乎所有古菌中，并构成一种适应性免疫系统，通过识别噬菌体和质粒然后降解它们的 DNA 来保护它们免受侵害[1]。 Barrangou 等人对这种免疫机制的基本认识是他们提出的，他们表明嗜热链球菌可以通过将传染性病毒的基因组片段整合到其 CRISPER 基因座中来获得对噬菌体的抗性。[2] 几乎所有细菌基因组都有 CRISPER-Cas9 基因座。这些基因座由成簇的直接回文重复序列组成，每个重复序列后面都是先前暴露于外来 DNA 的短片段间隔 DNA [3][4]。重复序列通常长 28 到 37 个核苷酸，在单个基因座中是相同的。散在的核苷酸序列称为间隔，来自外来病毒。间隔序列转录为 CRISPERRNA (crRNA)。CRISPER 基因座还包含编码互补反式激活 Crisper RNA (tracrRNA) 的 DNA 序列和编码核酸酶的各种 Crisper 相关基因 (cas)。这些 crRNA 与互补反式激活 Crisper RNA (tracrRNA) 杂交，并作为双链一起识别互补的外来核苷酸序列。
Alt-R HDR 设计工具和 HDR 供体寡核苷酸
图 1.与其他修饰相比，具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 图 1.与其他修饰相比，具有 Alt-R HDR 修饰的供体寡核苷酸表现出更高的 HDR 效率。 （A）供体寡核苷酸修改的示意图。 （B）每次修改的 HDR 效率。使用 4D-Nucleofector™ 系统（Lonza）将四个靶向基因位点的 RNP 复合物（2 µM）与 0.5 µM 单链 HDR 供体寡核苷酸通过电穿孔共转染到 Jurkat 和 HeLa 细胞中。使用的 RNP 复合物是 Alt-R Sp HiFi Cas9 Nuclease V3，以及 Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA 和 tracrRNA。 使用了三种类型的供体寡核苷酸：未经任何修饰的寡核苷酸（未修饰的）、具有硫代磷酸酯键的寡核苷酸（PS 修饰的）和具有 Alt-R HDR 修饰的寡核苷酸（Alt-R HDR 修饰的）。 电穿孔后 48 小时 (HeLa) 或 72 小时 (Jurkat) 提取基因组 DNA。通过在 Illumina™ MiSeq™ 系统 (v2 化学、150 bp 双端读取) 上进行扩增子测序来测量 HDR 效率。
基于工程双组分向导 RNA 的分子接近传感器
合成生物学的目标之一是能够设计具有可编程输入和输出的任意分子电路。此类电路将电子电路和自然电路的特性结合起来，以可预测的方式在活细胞内处理信息。基因组编辑是合成分子电路的潜在强大组成部分，无论是用于调节目标基因的表达还是用于将信息稳定地记录到基因组 DNA 中。然而，将蛋白质-蛋白质相互作用或诱导接近等分子事件编程为基因组编辑的触发因素仍然具有挑战性。在这里，我们展示了一种称为“P3 编辑”的策略，它将蛋白质-蛋白质接近与功能性 CRISPR-Cas9 双组分向导 RNA 的形成联系起来。通过设计 crRNA：tracrRNA 相互作用，我们证明了各种已知的蛋白质-蛋白质相互作用以及化学诱导的蛋白质结构域二聚化可用于激活人类细胞中的原始编辑或碱基编辑。此外，我们还探索了 P3 编辑如何整合基于 ADAR 的 RNA 传感器的输出，从而可能允许特定 RNA 在更大的电路中诱导特定的基因组编辑。我们的策略增强了基于 CRISPR 的基因组编辑的可控性，有利于其在活细胞中部署的合成分子回路中的应用。
基于设计的，双组分指南RNA
合成生物学的目标之一是实现具有可编程输入和输出的任意分子回路的设计。这样的电路桥接了电子和自然电路的性质，以可预测的活细胞内处理信息。基因组编辑是合成分子回路的潜在强大组成部分，无论是用于调节靶基因的表达还是稳定地记录信息到基因组DNA。然而，编程分子事件，例如蛋白质 - 蛋白质相互作用或作为基因组编辑触发因素诱发的接近性仍然具有挑战性。在这里，我们演示了一种称为P3编辑的策略，该策略将蛋白质 - 蛋白质接近性与功能性CRISPR-CAS9双组分指南RNA的形成联系起来。通过工程化crRNA：tracrrna相互作用，我们证明了各种已知的蛋白质 - 蛋白质相互作用以及化学诱导的蛋白质结构域的二聚化，可用于激活人类细胞中的素数编辑或基础编辑。此外，我们探讨了P3编辑如何结合基于ADAR的RNA传感器的输出，有可能允许特定的RNA在较大电路中诱导特定的基因组编辑。我们的策略增强了基于CRISPR的基因组编辑的可控性，从而促进了其在活细胞中部署的合成分子电路中的使用。
基于工程双组分向导 RNA 的分子接近传感器
合成生物学的目标之一是能够设计具有可编程输入和输出的任意分子电路。此类电路将电子电路和自然电路的特性结合起来，以可预测的方式在活细胞内处理信息。基因组编辑是合成分子电路的潜在强大组成部分，无论是用于调节目标基因的表达还是用于将信息稳定地记录到基因组 DNA 中。然而，将蛋白质-蛋白质相互作用或诱导接近等分子事件编程为基因组编辑的触发因素仍然具有挑战性。在这里，我们展示了一种称为“P3 编辑”的策略，它将蛋白质-蛋白质接近与功能性 CRISPR-Cas9 双组分向导 RNA 的形成联系起来。通过设计 crRNA：tracrRNA 相互作用，我们证明了各种已知的蛋白质-蛋白质相互作用以及化学诱导的蛋白质结构域二聚化可用于激活人类细胞中的原始编辑或碱基编辑。此外，我们还探索了 P3 编辑如何整合基于 ADAR 的 RNA 传感器的输出，从而可能允许特定 RNA 在更大的电路中诱导特定的基因组编辑。我们的策略增强了基于 CRISPR 的基因组编辑的可控性，有利于其在活细胞中部署的合成分子回路中的应用。
cas9兔子mab
CRISPR相关蛋白9（CAS9）是RNA引导的DNA核酸酶，是Pyogenes链球菌CRIS-CRISPR-antivirAniviral免疫系统的组成部分，可提供针对外肌小体遗传材料的适应性免疫。CRISPR抗病毒作用的机制涉及三个步骤：（i）宿主细菌获取外国DNA； （ii）CRISPR RNA（CRRNA）的合成和成熟，然后形成RNA-CAS核酸酶 - 蛋白质复合物； （iii）通过宿主细菌获取外源DNA；该络合物识别出外源DNA，并通过CAS核酸酶活性通过裂解而定向干扰。II型CRISPR/CAS抗病毒免疫系统为精确的基因组编辑提供了强大的工具，并具有特定调节基因和治疗应用的潜力。必须在细胞中引入或表达CAS9蛋白和引导RNA（包括CRRNA和反式激活CRRNA（tracroRNA）之间的融合）。导向RNA的5'末端的20个核苷酸序列将Cas9引导到特定的DNA靶位点。因此，可以“编程” Cas9以在体外以及细胞和生物中切割各种DNA位点。CRISPR/CAS9基因组编辑工具已用于包括小鼠和人类细胞在内的许多生物中。研究表明，CRISPR可用于在啮齿动物和灵长类动物胚胎干细胞中产生突变等位基因或报告基因。