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CRISPR-CAS9编辑和转录组的联合单细胞分析揭示了广泛的脱靶事件及其对基因表达的影响
具有CRISPR-CAS9的基因组工程中的长期障碍一直无法衡量Cas9编辑结果及其在单细胞分辨率下的功能效应。在这里，我们提出了Superb-Seq，这是一种利用T7原位转录和单细胞RNA测序的新技术，以共同测量靶向靶标Cas9编辑及其对基因表达的影响。我们在10,000 k562细胞上进行了高级seq，靶向了四个用七个引导RNA的染色质重塑基因。Superb-Seq在所有七个目标站点和其他36个非目标位点上确定了11,891个编辑事件。尽管选择了七个指南的高特异性，但其中有六个导致靶向脱靶编辑，频率从0.03％到18.6％的细胞范围不等。在USP9X的第一个内含子中，明显的脱靶编辑破坏了该基因的表达和超过150个下游基因。总而言之，由于罕见和常见的编辑事件的结合，CAS9非目标是普遍存在的，主要发生在靶向基因的内含子内，并且可以对基因表达产生广泛的影响。Superb-Seq使用现成的套件，标准设备，并且不需要病毒，这将使全基因组CRISPR屏幕能够在不同的细胞类型中以及与临床相关的指南的功能表征。
CRISPR-CAS9编辑和转录组的联合单细胞分析揭示了广泛的脱靶事件及其对基因表达的影响
具有CRISPR-CAS9的基因组工程中的长期障碍一直无法衡量Cas9编辑结果及其在单细胞分辨率下的功能效应。在这里，我们提出了Superb-Seq，这是一种利用T7原位转录和单细胞RNA测序的新技术，以共同测量靶向靶标Cas9编辑及其对基因表达的影响。我们在10,000 k562细胞上进行了高级seq，靶向了四个用七个引导RNA的染色质重塑基因。Superb-Seq在所有七个目标站点和其他36个非目标位点上确定了11,891个编辑事件。尽管选择了七个指南的高特异性，但其中有六个导致靶向脱靶编辑，频率从0.03％到18.6％的细胞范围不等。在USP9X的第一个内含子中，明显的脱靶编辑破坏了该基因的表达和超过150个下游基因。总而言之，由于罕见和常见的编辑事件的结合，CAS9非目标是普遍存在的，主要发生在靶向基因的内含子内，并且可以对基因表达产生广泛的影响。Superb-Seq使用现成的套件，标准设备，并且不需要病毒，这将使全基因组CRISPR屏幕能够在不同的细胞类型中以及与临床相关的指南的功能表征。
东北红豆杉 (Taxus cuspidata) 的完整线粒体基因组 (...
背景：裸子植物占种子植物六个谱系中的五个。然而，大多数已测序的植物线粒体基因组（线粒体基因组）都是针对被子植物生成的，而仅针对六种裸子植物生成了线粒体基因组序列。特别是，除了针叶树 II（非松科针叶树或柏树门）之外，所有主要种子植物谱系都有完整的线粒体基因组，针叶树 II 是一个包括六个科的重要谱系，这阻碍了对裸子植物线粒体基因组多样性和进化的全面了解。结果：在这里，我们报告了针叶树 II 中东北红豆杉的完整线粒体基因组。与之前发布的裸子植物线粒体基因组相比，我们发现红豆杉和千岁兰的线粒体基因组各自丢失了许多基因，而苏铁、银杏和松科的线粒体基因组中所有基因都得到了鉴定。裸子植物的一些谱系中也丢失了多个 tRNA 基因和内含子，与被子植物中观察到的模式相似。一般来说，裸子植物中的基因簇可能比被子植物中的保守性更低。此外，在红豆杉和千岁兰线粒体基因组中发现的 RNA 编辑位点比其他线粒体基因组中少，这可能与这两个物种中内含子较少和基因频繁丢失有关。
针对急性髓样白血病和胃癌的靶向降解
在组织启动子控制的物种（CGI）的物种r 2之间r 2之间的r 2 r 2 0.75 * 0.03 0.12 *启动子（其他）0.65 ** 0.05 0.05 0.14 *基因0.88 * 0.02 0.13 * 0.02 0.13 *内含子0.55 * 0.55 * 0.09 * 0.09 * 0.20 * 0.61 * 0.61 * 0.04 0.04 0.04 0.04 0. 30. 3. Un 0. 30. 3. Un 0. 3. Undron 0.68 * 0.04 0.13 ** 3' UTRs 0.64 * 0.05 0.15 * TEs 0.51 * 0.11 * 0.23 * CR1s 0.49 * 0.12 * 0.24 * LTRs 0.55 * 0.10 * 0.22 * Fixed differences 0.47 * 0.16 * 0.30 * Family-wise (0.1) adjusted p-value levels: * < 0.05 ** < 0.005 *** < 0.0005 281在组织启动子控制的物种（CGI）的物种r 2之间r 2之间的r 2 r 2 0.75 * 0.03 0.12 *启动子（其他）0.65 ** 0.05 0.05 0.14 *基因0.88 * 0.02 0.13 * 0.02 0.13 *内含子0.55 * 0.55 * 0.09 * 0.09 * 0.20 * 0.61 * 0.61 * 0.04 0.04 0.04 0.04 0. 30. 3. Un 0. 30. 3. Un 0. 3. Undron 0.68 * 0.04 0.13 ** 3' UTRs 0.64 * 0.05 0.15 * TEs 0.51 * 0.11 * 0.23 * CR1s 0.49 * 0.12 * 0.24 * LTRs 0.55 * 0.10 * 0.22 * Fixed differences 0.47 * 0.16 * 0.30 * Family-wise (0.1) adjusted p-value levels: * < 0.05 ** < 0.005 *** < 0.0005 281在组织启动子控制的物种（CGI）的物种r 2之间r 2之间的r 2 r 2 0.75 * 0.03 0.12 *启动子（其他）0.65 ** 0.05 0.05 0.14 *基因0.88 * 0.02 0.13 * 0.02 0.13 *内含子0.55 * 0.55 * 0.09 * 0.09 * 0.20 * 0.61 * 0.61 * 0.04 0.04 0.04 0.04 0. 30. 3. Un 0. 30. 3. Un 0. 3. Undron 0.68 * 0.04 0.13 ** 3' UTRs 0.64 * 0.05 0.15 * TEs 0.51 * 0.11 * 0.23 * CR1s 0.49 * 0.12 * 0.24 * LTRs 0.55 * 0.10 * 0.22 * Fixed differences 0.47 * 0.16 * 0.30 * Family-wise (0.1) adjusted p-value levels: * < 0.05 ** < 0.005 *** < 0.0005 281
与 IRF2BPL 基因变异相关的新型人类神经发育和神经退行性疾病——机制和治疗途径
最近，与神经发育和神经退行性疾病 NEDAMSS（伴有退化、异常运动、失语和癫痫发作的神经发育障碍）相关的大量表型异常与无内含子基因 IRF2BPL 中罕见的单核苷酸多态性 (SNP) 或插入和缺失变异 (Indel) 有关。到目前为止，已通过全外显子组测序确定了 34 名患者，他们携带不同的杂合致病变异，这些变异横跨无内含子基因，从 N 端的第一个多聚谷氨酰胺束到蛋白质 C 端的 C3HC4 RING 结构域。因此，患者的表型谱高度异质性，范围从异常的神经认知发育到伴有发育和癫痫发作相关脑病的严重神经退行性病程。虽然 IRF2BPL 相关疾病的治疗主要通过对症多学科治疗来缓解患者的症状，但目前尚无完全缓解个别患者症状的希望。然而，CRISPR-Cas9 衍生基因编辑工具的最新进展，导致了碱基编辑器 (BE) 和主要编辑器 (PE) 的产生，为治疗 NEDAMSS 和其他神经发育和神经退行性疾病提供了一条令人鼓舞的新治疗途径，这些疾病含有中枢神经系统有丝分裂后细胞群中的 SNP 或较小的 Indel，因为它能够在不产生双链断裂的情况下产生位点特异性 DNA 序列修饰，并招募非同源 DNA 末端连接修复机制。
FXN 通过间接效应表达
弗里德赖希共济失调是一种无法治愈的疾病，由 frataxin (FXN) 蛋白缺乏引起，主要由 FXN 基因内含子 1 中的 GAA 重复扩增引起。在这里，我们鉴定了与 FXN 前 mRNA 第一个内含子内的两个区域互补的反义寡核苷酸 (ASO)，它可以使患者成纤维细胞中的 FXN mRNA 增加约 2 倍。通过在每个区域鉴定多个重叠的 FXN 激活 ASO、两个独立的 RNA 定量分析和多个管家基因的标准化，证实了 FXN mRNA 的增加。对删除 ASO 结合位点的细胞进行的实验表明，ASO 诱导的 FXN 激活是由间接效应驱动的。 RNA 测序分析表明，两种 ASO 诱导了相似的转录组范围变化，与野生型细胞的转录组不同。这种 RNA 测序分析未识别出 ASO 之间共有的直接碱基配对脱靶基因。错配研究确定了 ASO 中 FXN 激活所需的两个富含鸟苷酸的基序 (CCGG 和 G 4 )。我们的 ASO 的磷二酰胺吗啉寡聚体类似物不会激活 FXN，这表明存在 PS 骨架介导的效应。我们的研究表明，在采用基因激活等新机制的寡核苷酸研究中，多个详细的对照实验和靶标验证非常重要。
叶绿体基因组完整分析：东方山羊豆的结构、系统发育关系及山羊豆科植物的进化推断
摘要：东方山羊豆是豆科植物，具有重要的生态和经济价值，因其抗逆性强、蛋白质含量高而被广泛栽培。然而，东方山羊豆的基因组信息尚未见报道，限制了其进化分析。由于基因组较小，叶绿体相对容易获得基因组序列以进行系统发育研究和分子标记开发。本文对东方山羊豆叶绿体基因组进行了测序和注释。结果表明，东方山羊豆叶绿体基因组长度为125,280 bp，GC含量为34.11%。共鉴定出107个基因，包括74个蛋白质编码基因，29个tRNA和4个rRNA。东方山羊豆叶绿体基因组中丢失了一个反向重复（IR）区。此外，与其近缘种G. officinalis的叶绿体基因组相比，有5个基因（ rpl22 、 ycf2 、 rps16 、 trnE-UUC 和 pbf1 ）丢失。共检测到84个长重复序列和68个简单序列重复序列，可作为G. orientalis及其近缘种遗传研究的潜在标记。我们发现，在G. officinalis与其他3个Galegeae物种（ Calophaca sinica 、 Caragana jubata 、 Caragana korshinskii ）的两两比较中，petL 、 rpl20 和 ycf4 3个基因的Ka/Ks值大于1，表明这3个基因受到了正向选择。 15个Galegeae物种的比较基因组分析表明，大多数保守的非编码序列区域和两个基因区域（ycf1和clpP）分化程度较高，可作为DNA条形码用于快速准确的物种鉴定。基于ycf1和clpP基因构建的系统发育树证实了Galegeae物种间的进化关系。此外，在所分析的15个Galegeae物种中，Galega orientalis在ycf1基因中有一个独特的30 bp内含子，而Tibetan liangshanensis在clpP基因中缺少两个内含子，这与现有只有IR缺失支（IRLC）中的甘草属物种缺少两个内含子的结论相反。总之，首次确定并注释了G. orientalis的完整叶绿体基因组，这可以为Galegeae属内尚未解决的进化关系提供见解。
mRNA 技术 - 洞察报告
mRNA 在转录过程中在细胞核中合成，产生前 mRNA，然后加工成 mRNA。在转录过程中，遗传信息由 RNA 聚合酶从 DNA 中复制，形成所谓的前 mRNA。然后，该分子通过添加 5' 帽和 3' poly(A) 尾巴进行加工，并通过在细胞核中剪接内含子序列形成五组分成熟 mRNA 结构。mRNA 结构中的每个组分在细胞质中核糖体的运输、翻译和有效生产蛋白质方面都有特定的作用（见图 3）。
完全从克隆的互补DNA中拯救第一个alphanucleorhabdovirus：一种有效的载体，用于MAI
fi g u r e 1从植物中的全长cDNA克隆中拯救感染性玉米镶嵌病毒（MMV）。（a）PJL-MMV-WT，PTF-N＆P和PJL-L-Lintron质粒的示意图。全长的MMV型质粒设计用于转录，以产生MMV抗原组RNA（AgRNA），并包含位于截短的CAMV Double 35S启动子（2×35s）和肝炎乙肝（RZ）rzl89 bjl89 bilary prinary prinary pharine pharione phinary phinary phinary phincy sequence之间的全长MMV cDNA。请注意，序列以抗原（mRNA）感显示。在PTF二进制质粒中的2×35s和35s终结序列之间插入了N和P的全长cDNA。L的全长cDNA与植物内含子ST-LS1插入2×35s和35S终结序列之间的植物内含子cDNA，在PJL89二元质粒中。（b）用含有PJL-MMV-GFP，PTF-N＆P和PJL-L-INTRON质粒的农杆菌菌株的农杆菌菌株的示意图，并说明了PJL-MMV-GFP质粒构建。全长PJL-MMV-GFP包含重复的N/P基因连接，将MMV抗原组cDNA的N和P基因之间的GFP基因两侧。le，领导者； TR，拖车； Ter，终结者； TEV，烟草蚀刻病毒； LB，左边界序列； RB，右边界序列。（c）通过烟草本尼亚娜（Nicotiana Benthamiana）的MMV救援程序的例证，并转移到玉米和Peregrinus Maidis Planthoppers。dpi，接种后天。图1C：使用biore nder.com
生理学。 res。 69：967-994，2020 https：//doi.org/10.33549/physiolres.934529审查线粒体DI
简介线粒体是正常生理与健康的古老细胞器（Henze and Martin 2003）。他们负责细胞代谢的各个方面。氧化磷酸化系统（OXPHOS）位于线粒体内部膜上，产生了约90％的细胞能量货币，三磷酸腺苷（ATP）（Rich 2003）。此外，线粒体参与了许多其他功能 - 这些包括三羧酸周期（即krebs循环），尿素循环，糖异生和生酮发生，钙信号的酶，自适应热发生，离子稳态，脂肪酸氧化，氨基酸代谢，脂质代谢以及反应氧的生理产生（ROS）。线粒体还可以从类固醇，出血和铁 - 硫簇的生物合成中构成单个步骤，并在程序性细胞死亡中发挥作用（Voet等人2013）。此外，线粒体结构和功能在两个基因组的控制下，核和线粒体。与核基因组不同，线粒体DNA（mtDNA）是母遗传的，并且每个细胞中最多有几千份，具体取决于细胞类型（Sciaccco等人。1994，Taylor和Turnbull 2005）。 大多数序列是编码，缺乏内含子 - 外观结构，大多数基因都位于DNA分子的一条上。 1 500个线粒体蛋白中的绝大多数由核基因编码。 线粒体DNA仅针对13个结构1994，Taylor和Turnbull 2005）。大多数序列是编码，缺乏内含子 - 外观结构，大多数基因都位于DNA分子的一条上。1 500个线粒体蛋白中的绝大多数由核基因编码。线粒体DNA仅针对13个结构