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World File Search System单倍体
衣原体作为一种模型系统，使用遗传学，生物化学和显微镜
单细胞绿色藻类Reinhardti I，在发现目前知道的有关Cilia和Flipella的组成，组装和功能的许多知识中发挥了核心作用。衣原体结合了出色的遗传学，例如将细胞作为单倍体或二倍体和进行四倍分析的能力，并在没有细胞裂解的情况下单个步骤脱离和分离agella的无与伦比的能力。在衣原体中可能存在的遗传学和生物化学的组合使纤毛的许多关键组成部分可以通过寻找定义的突变体中缺少的蛋白质来识别。很少有其他模型生物可以允许这种遗传和生化方法的无缝组合。其他主要优势包括诱导高度同步诱导的能力再生的能力，从而可以测量植物生长的动力学，以及衣原体瘤的能力，以及在玻璃覆盖物中粘附在玻璃上，可以轻松地锻炼玻璃，并在内部均可锻炼。单分子分辨率。这些优势继续努力支持衣原体作为模型系统，现在通过广泛的基因组资源，敲除菌株的收集和有效的CRISCPR基因编辑来增强。在研究与动物发育或器官生理学相关的睫状功能方面存在明显的局限性，在研究纤毛和叶酸的基本生物学时，衣原体在速度，效率，效率，成本以及可以带来的问题的方法方面只是无与伦比的。
使用 Yr7 抗黄锈病基因演示小麦基因图谱框架
我们采用了三种方法来定位抗黄锈病基因 Yr7，并确定小麦中相关的 SNP。首先，我们使用传统的 QTL 定位方法，即双单倍体 (DH) 群体，并将 Yr7 定位到 2B 染色体的低重组区域。为了精细定位 QTL，我们使用了关联定位面板。两个群体都进行了 SNP 阵列基因分型，允许根据常见的分离 SNP 进行 QTL 比对和全基因组关联扫描。对跨越 QTL 间隔的关联面板进行分析，将间隔缩小到单个单倍型块。最后，我们使用对抗性和易感性 DH 群体进行测序定位，以识别间隔中与之前建议的 Yr7 候选基因具有高同源性的候选基因，并以更高的多态性密度填充 Yr7 间隔。我们强调了将测序映射结合起来的强大功能，它提供了区间内基于基因的分离多态性的完整列表，并具有关联映射面板的高重组、低 LD 精度。我们的测序映射方法适用于任何性状，我们的结果验证了该方法在小麦中的有效性，在小麦中，通过近乎完整的参考基因组序列，我们能够定义一个包含致病基因的小区间。
鉴定人类细胞中复制应力反应的关键因素Louise M.E. Janssen 1，Empar Baltasar Perez 1，Chantal Vaartin
方法在补充了10％FCS，1％谷歌补充剂（Gibco），100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉菌素的IMDM（Gibco）中培养了衍生成近单倍型HAP1细胞的细胞培养。siRNA转染是根据制造商的指南使用Rnaimax（Invitrogen）进行的。在这项研究中使用了以下siRNA：Sinon-targetable（Dharmacon），Sipolg2（地平线，TargetPlus，SmartPool），SIMRPL23（Horizon，Targetplus，TargetPlus，Smartpool）。将所有药物（Aphidicolin，Hu，Olaparib，Rad51i（B02），DNA-PKI（NU74441）和寡霉素A）溶解在DMSO中，并以指示浓度使用。细胞使用具有137CS源的γ提取器（最佳疗法）进行γ辐射。生长测定HAP1细胞以1500个细胞/孔的密度将HAP1细胞铺在96孔板中，并被视为5天。5天后，使用100％甲醇固定细胞，并在室温下使用Crystal Violet染色2H。随后，将晶体紫溶解在10％乙酸中，并使用Biotek Epoch Epoch分光光度计在595 nm处测量强度。使用非线性拟合，sigmoidal，4pl，x是log（浓度），将这些测量值用于棱镜中的IC50计算。在9mm玻璃盖上生长免疫荧光细胞，并在室温下以4％甲醛和0.2％Triton X-100固定10分钟。使用了以下抗体：人类抗克雷斯特（Cortex Biochem，CS1058），兔抗PH3SER10（Campro，＃07-081），小鼠抗ERCC6L（PICH）（ABNOVA，ABNOVA，000548421-B01P）。所有初级抗体在4°C的夜间孵育。使用固定缓冲液I（BD生物科学）固定细胞。细胞。二级抗体（分子探针，Invitrogen）和DAPI在室温下孵育2小时。使用延长金（Invitrogen）安装盖玻片。使用具有60倍1.40 Na油目标的Deltavision Deonvolution显微镜（Applied Precision）获取图像。SoftWorx（应用精度），ImageJ，Adobe Photoshop和Illustrator CS6用于处理获得的图像。单倍体插入诱变筛选基因对用APH或HU处理的HAP1细胞的存活至关重要，如先前所述35，使用单倍体插入诱变筛查鉴定。诱变的HAP1细胞是从Brummelkamp实验室获得的。简短地，获得HAP1细胞的诱变如下：在HEK293T细胞中产生了基因陷阱逆转录病毒。每天两次收获逆转录病毒至少三天，并通过离心（使用SW28转子进行2小时，21,000 rpm，4°C，4°C）进行沉淀。在8μg/ml硫酸素硫酸素的存在下，在T175烧瓶中至少连续两天，在8μg/ml硫酸素的存在下，将大约4000万个HAP1细胞通过浓缩基因陷阱病毒的转导而被诱变。在包含10％DMSO和10％FCS的IMDM培养基中冷冻诱变细胞。解冻后，在存在27.5 nm adphidicolin或100μmHu的情况下，将诱变的HAP1细胞转移了10天。传递后，通过胰蛋白酶-EDTA收集细胞，然后进行沉淀。为了最大程度地减少潜在地含有杂合突变的二倍体细胞的混杂，用DAPI染色固定的细胞，以允许使用Astrios Moflo对G1单倍体DNA含量进行分类。将3000万个排序的细胞在56°C下裂解过夜，以使使用DNA迷你试剂盒（QIAGEN）进行基因组DNA分离。插入位点映射基因陷阱插入位点通过LAM-PCR放大，然后进行捕获，ssDNA接头连接和指数放大，并在测序之前使用含有Illumina适配器的引物，如前所述，如前所述35。映射和插入位点的分析以前描述了78。简短地，在对HISEQ 2000或HISEQ 2500（Illumina）进行测序之后，将插入位点映射到人类基因组（H19），允许一个不匹配，并与RefSeq坐标相交，以将插入位点分配给基因。基因区域在相对链上重叠的基因区域没有考虑进行分析，而对于在相同链基因名称上重叠的基因是串联的。对于每种复制和两种药物治疗（APH或HU）基因的必要性都是通过二项式检验确定的。合成致死性。一个基因通过所有Fisher的测试，其p值截止为0.05，效应大小至少为0.12（减法比率wt sense比率 - 复制应力条件感官比率）。
基因调控和基因编辑工具及其在视网膜疾病和神经保护中的应用：从概念验证到临床试验
基因编辑和基因调控领域正在不断开发新的、更安全的工具，超越最初的 CRISPR/Cas9 技术。随着更多先进应用的出现，了解和建立更复杂的基因调控和编辑工具对于有效的基因治疗应用至关重要。眼科是基因治疗应用的领先领域之一，有 90 多项临床试验和大量概念验证研究。大多数临床试验都是基因替代疗法，非常适合单基因疾病。尽管 Luxturna 取得了临床成功，但基因替代疗法仍然存在一些局限性，包括靶基因的大小、启动子的选择以及致病等位基因。因此，进一步尝试采用新的基因调控和基因编辑应用对于针对现有方法无法实现的视网膜疾病至关重要。CRISPR-Cas9 技术凭借其基因编辑特性为矫正基因疗法打开了大门。 CRISPR-Cas9 相关工具（包括碱基修饰器和主要编辑）的进步已经提高了碱基编辑方法的效率和安全性。虽然碱基编辑是一项非常有前途的努力，但不干扰基因组变化的基因调控方法也正在成为更安全的替代方案。反义寡核苷酸是纠正剪接缺陷或消除突变 mRNA 的最常用方法之一。更复杂的基因调控方法（如人工转录因子）也是另一个发展中的领域，它允许针对单倍体不足条件、功能等效基因、
产生两个杂合的 GATA2 CRISPR/Cas9-...
GATA2 缺陷属于世界卫生组织 (WHO) 新近确定的一组易患髓系恶性肿瘤的遗传综合征（Smith et al., 2004）。具有种系杂合 GATA2 突变的个体表现出非常复杂和多系统的表现型，包括血细胞减少导致的 MDS、免疫缺陷（涉及 B、NK、单核细胞、CD4 +、DC 细胞谱系）、耳聋和淋巴水肿（Hahn et al., 2011）。根据文献报道，至少 75% 的 GATA2 突变携带者在估计的中位年龄 20 岁时患上 MDS/AML（Wlodarski et al., 2016）。如今，化疗和同种异体造血干细胞 (HSC) 移植仍然是唯一具有良好反应的治疗方法。由于缺乏可靠的疾病模型系统，我们无法从机制上理解 GATA2 单倍体不足如何影响造血发育。种系 GATA2 突变要么是截短的功能丧失 (LOF) 突变，要么是 ZF2 的错义突变，要么是破坏内含子 4 增强子位点的突变 ( Wlodarski et al., 2016 )。这些突变被认为会导致 GATA2 功能降低/丧失，特别是消除 ZF2 的 DNA 结合功能 ( Chong et al., 2018 )。迄今为止，只有少数种系 GATA2 突变进行了功能研究。因此，使用精确的基因编辑策略，我们生成了携带两种最
几乎无间隙，高度连续的参考基因组，用于populus ussuriensis的双倍线，使高级基因组研究
抽象的人群物种，尤其是trichocarpa，长期以来一直是基因组研究的模型树，这是由于完全测序的基因组。然而，高杂合性和重复区域的存在，包括丝粒和核糖体RNA基因簇，剩下了59个未解决的间隙，占三分法P. trichocarpa基因组的3.32％。在这项研究中，改进了愈伤组织诱导方法，以从P. ussuriensis花药中得出双倍的单倍体（DH）愈伤组织。利用长阅读测序，我们成功地组装了一个几乎没有间隙的，端粒到telomere（T2T）P。ussuriensis基因组，跨越了412.13 MB。该基因组组件仅包含7个间隙，其重叠n50长度为19.50 MB。注释显示该基因组中有34,953个蛋白质编码基因，比trichocarpa多465个。值得注意的是，中心区域的特征是高阶重复序列，我们在所有DH基因组染色体中鉴定了和注释的中心粒区域，这是杨树的第一个。衍生的DH基因组表现出与毛thocarpa的高共线性，并显着填补了后者基因组中存在的空白。此T2T P. ussuriensis参考基因组不仅会增强我们对基因组结构的理解，并在杨树属内的功能增强了我们的功能，而且还为杨树基因组和进化研究提供了宝贵的资源。
hap1，一种使用CRISPR-CAS9
使用下一代测序（NGS）技术对复杂人类疾病（如癌症）的突变景观的表征发挥了作用。但是，尽管鉴定出疾病遗传变异的鉴定，但其功能尚未完全阐明，以便对患者护理产生明显的影响。单倍体人细胞模型已成为功能基因研究的首选工具，因为它们仅包含一个基因组副本，因此可以显示遗传变异的未掩盖表型。在过去的几年中，人类近二倍体细胞系HAP1已被广泛合并为功能遗传研究最喜欢的细胞系模型之一。它的快速营业额加上这样一个事实，即仅需要修改一个等位基因才能表达随后的所需表型，使该人类细胞系成为CRISPR-CAS9技术进行基因编辑的有价值的工具。本综述研究了使用CRISPR-CAS9系统在功能遗传研究和高通量遗传筛选中HAP1细胞系模型的最新用途。它涵盖了其用于开发新的和相关的疾病模型以进一步阐明基因功能的用途，并创建了新的方法来了解人类疾病的遗传基础。我们将涵盖在HAP1上使用CRISPR-CAS9技术的优势和潜力，以轻松，有效地研究基因功能的功能解释和人类单核苷酸遗传变异的识别NGS技术及其对临床实践和患者护理的变化的影响。
MEDG 420 教学大纲 2024W 2024 年 8 月 2 日 第 1/6 页
模块 1：识别导致孟德尔疾病的遗传变异 (Jan Friedman) 9 月 4 日星期三 – 遗传变异 9 月 9 日星期一 – 疾病基因识别 I 9 月 11 日星期三 – 疾病基因识别 II 9 月 16 日星期一 – 疾病基因识别 III 9 月 18 日星期三 – 疾病基因识别 IV 和人类遗传变异 9 月 23 日星期一 – 模块 1 嘉宾，Shelin Adam，理学学士、理学硕士、遗传咨询师、BC 儿童医院 模块 2：功能基因组学 (Mahmoud Pouladi) 9 月 25 日星期三 – 动物模型 – 无脊椎动物：蠕虫和苍蝇 9 月 30 日星期一 – 没有课程 – 真相与和解国庆日 10 月 2 日星期三 – 动物模型 – 脊椎动物：斑马鱼、鼠类和其他模型 10 月 7 日星期一 – 细胞模型 – 永生化、单倍体和 hPSC 模型 10 月 9 日星期三 – 正向遗传学/遗传筛选 10 月 14 日星期一 – 没有课程 – 感恩节 10 月 16 日星期三 – 功能基因组学项目和讨论 10 月 17 日星期四 – 第 2 部分嘉宾，待定 第 3 部分：基因治疗 (Stefan Taubert) 10 月 21 日星期一 – 什么是基因治疗？10 月 23 日星期三 – 基因治疗载体 10 月 28 日星期一 – 基因增强治疗
使用 CRISPR/Cas9- 改组酵母基因组...
尽管转座因子之间的同源重组可通过促进染色体重排来驱动酵母基因组进化，但其潜在机制的细节尚未完全阐明。在酿酒酵母基因组中，最常见的转座子类别是逆转录转座子 Ty1。在本文中，我们探讨了 Cas9 诱导的针对 Ty1 因子的双链断裂 (DSB) 如何在该酵母物种中产生基因组改变。在 Cas9 诱导后，我们观察到染色体重排（例如缺失、重复和易位）显著增多。此外，我们发现有丝分裂重组率升高，导致杂合性丧失。通过 Southern 分析结合短读和长读 DNA 测序，我们揭示了逆转录转座子中诱导的重组的重要特征。几乎所有的染色体重排都反映了 Ty1 元件处 DSB 的修复，这是通过非等位基因同源重组实现的；成簇的 Ty 元件是染色体重排的热点。相反，大部分（约四分之三）等位基因有丝分裂重组事件在独特序列中存在断点。我们的分析表明，后一些事件反映了 Ty 元件中产生的断端的广泛处理，这些断端延伸到独特序列中，从而导致断裂诱导的复制。最后，我们发现单倍体和二倍体菌株对用于修复双链 DNA 断裂的途径有不同的偏好。我们的研究结果表明，逆转录转座子中的 DNA 损伤在推动基因组进化方面的重要性。
通过 CRISPR/Cas 介导的同源重组在模型硅藻 Thalassiosira pseudonana 中进行有效的基因替换
CRISPR/Cas 能够对包括模型硅藻 Thalassiosira pseudonana 在内的许多不同植物和藻类进行靶向基因组编辑。然而，迄今为止，仅报道了通过同源重组 (HR) 实现的有效基因靶向适用于单倍体生命周期阶段的光合生物。在这里，使用 Golden Gate 克隆组装的 CRISPR/Cas 构建体能够在二倍体光合生物中实现高效的 HR。使用序列特异性 CRISPR/Cas 并与 dsDNA 供体基质配对，在 T. pseudonana 中诱导同源重组，从而用抗性盒 (FCP: NAT) 替换 silacidin、硝酸还原酶和脲酶基因。通过嵌套 PCR 筛选出高达约 85% 的 NAT 抗性 T. pseudonana 菌落对 HR 呈阳性。使用反向 PCR 方法确认了 FCP: NAT 在每个位点的精确整合。硝酸还原酶和尿素酶基因的敲除分别影响了硝酸盐和尿素的生长，而 T. pseudonana 中 silacidin 基因的敲除导致细胞尺寸显著增加，证实了该基因在中心硅藻中调节细胞尺寸的作用。HR 的高效基因靶向使 T. pseudonana 像 Nannochloropsis 和 Physcomitrella 一样易于遗传处理，从而迅速推进了功能性硅藻生物学、生物纳米技术和生物技术应用，这些应用旨在利用硅藻的代谢潜力。