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通过同源指导的修复介导的基因组编辑校正隐性营养不良表皮溶液
基因组编辑的技术，能够引入DNA序列中的精确变化，有可能导致新的遗传疾病治疗方法。表皮溶解Bullosa（EB）是一组以极端皮肤脆弱性为特征的稀有遗传疾病。具有最严重的表型之一的EB（RDEB）的隐性营养不良亚型，是由Col7a1突变引起的。在这项研究中，我们报告了一种基因编辑方法，用于基于体内同源指导的修复（HDR）基因校正，该方法使用了CRISPR-CAS9系统，该系统使用核糖核蛋白（RNP）复合物与供体与adeno相关的Veral Veral Vec-Vec-vec-tors（AAVS）结合使用。我们证明了在原代rdeb ker-固有细胞中实现含有疗法的舒适突变校正频率，其中包含不同的COL7A1突变以及有效的HDR介导的HDR介导的COL7A1模量，可在健康的索有索有索有线山脉CD34 +细胞和细胞中的细胞中（MSC）。这些结果是HDR介导的基因校正的概念证明，其不同细胞类型具有RDEB的治疗潜力。
重组工程：利用同源重组进行细菌遗传工程”。引自：分子生物学最新协议
细菌染色体和细菌质粒可通过同源重组在体内进行改造，使用 PCR 产物和合成寡核苷酸作为底物。这是可能的，因为噬菌体编码的重组蛋白可以有效地重新组合同源序列，这些序列短至 35 到 50 个碱基。重组允许插入或删除 DNA 序列，而不考虑限制位点的位置。本单元首先描述了表达重组功能的电转化感受态细胞的制备及其用 dsDNA 或 ssDNA 的转化。然后，它介绍了支持协议，这些协议描述了几种两步选择/反选择方法，这些方法可以在不留下目标 DNA 中任何不必要的变化的情况下进行遗传改变，以及一种从大肠杆菌染色体或共电穿孔 DNA 片段中将遗传标记（通过检索进行克隆）检索到质粒上的方法。附加方案描述了筛选未选择突变的方法、从重组菌株中去除有缺陷的原噬菌体的方法和其他有用的技术。Curr. Protoc. Mol. Biol. 106:1.16.1-1.16.39。C 2014 by John Wiley & Sons, Inc.
TOPH（蛋白质同源物的真实检索）：采用对比问答框架进行蛋白质搜索
另一方面，生物学仍然主要使用传统工具。BLAST 和隐马尔可夫模型在搜索大型蛋白质序列数据库方面有着悠久的使用历史，这些数据库通过残基重叠和基于比对的特征进行评分。基于结构的方法，例如 DALI ( Holm ，2020 ) 和 TM-align ( Zhang & Skolnick ，2005 ) 长期以来一直具有更高的灵敏度来查找远程同源物，但由于其速度和可用蛋白质结构的数量而难以获得更广泛的采用。随着 AlphaFold2 ( Jumper et al. ，2021 ) 等精确蛋白质结构预测方法的出现，使用以前的工具搜索同源结构已变得几乎站不住脚。基于深度学习的方法，例如 Foldseek（van Kempen 等人，2023 年）、TM-vec（Hamamsy 等人，2022 年）、SMAMPNN（Trinquier 等人，2022 年）、Progres（Greener & Jamali，2022 年）一直试图弥补这一差距，但尚无法与 DALI 的灵敏度或序列搜索的速度相媲美（Steinegger & S¨oding，2017 年）。
有缺陷的同源重组和基因组不稳定性预测胰腺癌中对碳离子放射疗法的反应性提高。
Defective Homologous Recombination and Genomic Instability Predict Increased Responsiveness to Carbon Ion Radiotherapy in Pancreatic Cancer Brock J. Sishc 1 , Janapriya Saha 1 , Elizabeth Polsdofer 1 , Lianghao Ding 1 , Huiming Lu 1 , Shih-Ya Wang 1 , Katy L. Swancutt 1 , James H. Nicholson 1 , Angelica Facoetti 2 , Arnold Pompos 1，Mario Ciocca 2，Todd A. Aguilera 1，Michael D.故事1，＃，$和Anthony J. Davis 1，＃
SIR2抗疾病蛋白的人类同源物通过TLR途径介导免疫
。cc-by-nc-nd 4.0国际许可证。是根据作者/资助者提供的预印本（未经同行评审认证）提供的，他已授予Biorxiv的许可证，以在2024年9月21日发布的此版本中显示此版本的版权持有人。 https://doi.org/10.1101/2024.09.18.613514 doi：Biorxiv Preprint
CRISPR-Cas9 工程化同源荧光素酶表达细胞系作为癌症研究的体外和体内模型
CRISPR-Cas9 系统为生物学基础研究和转化研究疾病模型的开发提供了强大的基因编辑工具。本研究的目的是利用包括 CRISPR-Cas9 和生物发光在内的先进技术来生成新的人类细胞系，用作癌症研究中的体外和体内模型。大约 50% 的黑色素瘤患者有 BRAF V600E 突变，并且通常在治疗几个月后对当前的 BRAF 抑制剂产生耐药性。KRAS G13D 是一种与对这些抑制剂的耐药性相关的获得性突变。在这项研究中，CRISPR-Cas9 用于将 KRAS G13D 点突变敲入 A375 恶性黑色素瘤细胞系，该细胞系也含有可靶向的 BRAF V600E 突变。由此产生的 KRAS G13D 突变同源系 A375 已在基因组、转录本和蛋白质生物功能水平上得到验证，在传统的 2D 和 3D 细胞培养中研究时，该突变系对 BRAF 抑制剂达拉非尼和维莫非尼表现出显著的抗性。基于上述体外模型，我们通过将稳定的荧光素酶报告基因引入同源 A375 和 KRAS G13D A375 细胞系，开发了用于活体动物生物发光成像的其他模型。对细胞内的相对和绝对生物发光信号进行了量化，发现发射 4.9 x 10 5 光子/细胞/秒（A375）和 3.5 x 10 5 光子/细胞/秒（KRAS G13D A375）。本研究采用皮下异种移植模型，并使用 Xenogen IVIS™ 成像系统量化体内活体生物发光信号，以将肿瘤生长与荧光素酶表达关联起来。A375-Luc2 和 KRAS G13D A375-Luc2 注射到裸鼠体内后均生长为皮下肿瘤，生物发光水平不断提高。此外，还开发了 5 对人类同源荧光素酶报告细胞系和 18 种人类和小鼠荧光素酶报告细胞系，用于研究各种癌症类型。总之，CRISPR-Cas9 技术和稳定的荧光素酶表达两种技术的结合可以生成同源荧光素酶表达细胞系，这些细胞系是阐明肿瘤发生机制和研究体外和体内药物反应的宝贵工具。
系统分析CRISPR/Cas9技术中提高同源直接修复（HDR）效率的因素
事实证明，CRISPR/Cas9 细菌系统是多种生物体中基因操作的有力工具，但同源直接修复 (HDR) 序列替换的效率远低于随机插入/缺失创建。许多研究集中于使用双 sgRNA、细胞同步化循环和合理设计的单链寡 DNA 核苷酸 (ssODN) 递送来提高 HDR 效率。在本研究中，我们评估了这三种方法在提高 HDR 效率方面的协同作用。我们选择了 TNF α 基因 (NM_000594) 进行测试，因为它在各种生物过程和疾病中起着至关重要的作用。我们的结果首次展示了使用两个具有不对称供体设计和三重转染事件如何显著提高 HDR 效率，从不可检测的 HDR 事件提高到 39% 的 HDR 效率，并提供了一种促进 CRISPR/Cas9 介导的人类基因组编辑的新策略。此外，我们证明了可以使用 CRISPR/Cas9 方法编辑 TNF α 基因座，这是一个在未来安全地纠正每位患者的特定突变的机会。
利用 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白高效生成同源原代人类髓系细胞
摘要 使用 CRISPR-Cas9 对原代人类细胞进行基因组工程改造彻底改变了细胞生物学的实验和治疗方法，但人类髓系细胞在遗传上仍然难以治疗。我们提出了一种通过核转染将 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 复合物直接递送到从外周血纯化的 CD14+ 人类单核细胞中的方法，从而实现高精确基因敲除率。这些细胞可以有效分化为单核细胞衍生的巨噬细胞或树突状细胞。该过程产生的基因编辑细胞保留了髓系分化和吞噬功能的关键标记。限制因子 SAMHD1 的基因消融使 HIV-1 感染增加了 50 多倍，证明了该系统在基因型-表型查询方面的强大功能。这种快速、灵活且可扩展的平台可用于人类髓系细胞在免疫信号、炎症、癌症免疫学、宿主-病原体相互作用等方面的遗传研究，并可促进新型髓系细胞疗法的开发。简介髓系细胞是健康和疾病免疫系统中的关键参与者（Germic 等人，2019 年；Lapenna 等人，2018 年；Worbs 等人，2017 年）。单核细胞和巨噬细胞在先天免疫系统的直接分支中发挥作用，对病原体或组织损伤作出反应，并帮助调节和解决组织炎症。作为专业的抗原呈递细胞，树突状细胞可协调适应性免疫反应。鉴于髓系细胞的核心作用，髓系细胞被确定为从发育和稳态调节到病原体反应、自身炎症性疾病、纤维化和恶性肿瘤等各个方面的关键参与者也就不足为奇了 (Chao 等人，2020 年；Engblom 等人，2016 年；Manthiram 等人，2017 年；Medzhitov 和 Janeway，2000 年、1997 年；Wynn 等人，2013 年)。更好地了解这些细胞的正常行为和致病行为对于进一步加深我们对各种疾病的机制理解至关重要，为发现和发展新疗法带来了希望。我们识别新治疗靶点和构建新细胞干预措施的能力与我们对相关原代细胞类型的基因操作能力同步发展。例如，小鼠基因方法揭示了小鼠巨噬细胞的显著多样性，而骨髓亚群的基因消融为临床中类似细胞的治疗靶向铺平了道路（Wynn 等人，2013 年）。CRISPR-Cas9 介导的基因靶向显著扩展了曾经难以治疗的细胞类型的潜力，促进了重要的发现工作和增强的原代 T 细胞细胞治疗方法（Roth 等人，2018 年；Schumann 等人，2015 年；Simeonov 和 Marson，2019 年；Stadtmauer 等人，2020 年），以及使用编辑的造血干细胞/祖细胞治疗衰弱性遗传疾病（Foss 等人，2019 年；Wu 等人，2019 年）。到目前为止，CRISPR-Cas9 在原代人类髓系细胞中效率低下，限制了人类免疫系统这些关键细胞的功能遗传学研究和基因组工程。已鉴定出 SAMHD1 是髓系细胞中阻止有效慢病毒转导的关键限制因子（Hrecka 等人，2011 年；Laguette 等人，
全面的基因组分析（CGP）套件的演变，以简化工作流并检测同源重组缺陷
•提取优化：用1或3小时的孵育提取16个FFPE样品。使用随附的QPCR评估提取的DNA的浓度和质量。•连接研究：测试了缩短的程序，并针对原始条件分析了关键的测序指标，以减少图书馆的准备工作。•较高的吞吐量研究：合并，测序并与8个样本进行了汇总，测序。•变体灵敏度：用Avenio CGP KIT V2对317 FFPE DNA样品进行测序。变体检测与参考方法F1CDX进行了比较。样品包括由QPCR评估的多种DNA质量。测序是在每个样品读取> 60m的Illumina NextSeq序列上进行的。使用FoundationOneⓡ分析平台进行数据分析。结果
使用3D生物打印的自体微型操纵同源脂肪组织来处理糖尿病足溃疡
抽象复发性难治性白血病代表了患者的困难人群。感知到的好处和潜在的副作用之间的平衡以及管理耐多药败血症的重要财务负担是决定挽救方案选择的因素。在这里，我们介绍了氟达拉滨，黄体，粒细胞 - 骨质刺激因子与硼替佐米的结合。形态完整的反应率为58％，50％的患者达到完全缓解。只有三名患者需要在缓解诱导期间接受重症监护病房的入院，66.6％的患者继续接受成功的造血干细胞移植。因此，事实证明，这是对其他挽救方案的可能性，更安全的替代品，同时使大量的患者能够获得缓解并继续进行同种异体干细胞移植。