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World File Search System荧光强度
使用 AAV 介导的原位基因标记可视化哺乳动物大脑中的 Arc 蛋白动力学和定位
活性调节的细胞骨架相关 (Arc) 蛋白对于突触可塑性和记忆形成至关重要。Arc 基因含有结构 GAG 逆转录转座子序列的残余，它产生的蛋白质可自组装成含有 Arc mRNA 的衣壳状结构。从神经元释放的 Arc 衣壳已被提议作为一种新的 mRNA 传递细胞间机制。尽管如此，仍然缺乏 Arc 在哺乳动物大脑中细胞间运输的证据。为了能够在体内追踪来自单个神经元的 Arc 分子，我们设计了一种腺相关病毒 (AAV) 介导的方法，使用 CRISPR/Cas9 同源独立靶向整合 (HITI) 将荧光报告基因标记到小鼠 Arc 蛋白的 N 端。我们表明，编码 mCherry 的序列可以成功敲入 Arc 开放阅读框的 5′ 端。虽然 Arc 起始密码子周围有 9 个 spCas9 基因编辑位点，但编辑的准确性高度依赖于序列，只有一个靶标导致框内报告基因整合。在海马中诱导长期增强 (LTP) 时，我们观察到 Arc 蛋白的增加与荧光强度和 mCherry 阳性细胞数量的增加高度相关。通过邻近连接分析 (PLA)，我们证明 mCherry-Arc 融合蛋白通过与突触后棘中的跨膜蛋白 stargazin 相互作用而保留了 Arc 功能。最后，我们在靠近编辑神经元的 mCherry 阳性棘的 mCherry 阴性周围神经元中记录了 mCherry-Arc 与突触前蛋白 Bassoon 的相互作用。这是第一项为哺乳动物大脑中 Arc 的神经元间体内转移提供支持的研究。
大量小鼠中性别、应变和脑细胞结构的横向差异
摘要 小鼠大脑是迄今为止研究最深入的哺乳动物大脑，但其细胞结构的基本测量方法仍然不清楚。例如，量化细胞数量以及性别、品系和细胞密度和体积的个体差异之间的相互作用对于许多区域而言是遥不可及的。Allen 小鼠大脑连接项目生成了数百个大脑的高分辨率全脑图像。虽然这些图像是为了不同的目的而创建的，但它们揭示了神经解剖学和细胞结构的细节。在这里，我们使用这个群体系统地表征小鼠大脑中每个解剖单元的细胞密度和体积。我们开发了一种基于 DNN 的分割流程，该流程使用图像的自发荧光强度来分割细胞核，即使在最密集的区域（例如齿状回）内也是如此。我们将我们的流程应用于来自 C57BL/6J 和 FVB.CD1 品系的 507 个雄性和雌性大脑。从全球来看，我们发现整体脑容量的增加不会导致所有区域的均匀扩张。此外，特定区域的密度变化通常与该区域的体积呈负相关；因此，细胞计数并不随体积线性变化。许多区域（包括多个皮质区域的 2/3 层）表现出明显的横向偏差。我们确定了特定于菌株或特定于性别的差异。例如，男性往往在扩展的杏仁核和下丘脑区域（MEA、BST、BLA、BMA 和 LPO、AHN）中拥有更多细胞，而女性在眼眶皮质 (ORB) 中拥有更多细胞。然而，个体间变异性始终大于单个限定词的效应大小。我们将此分析的结果作为社区的可访问资源提供。
利用微流体电穿孔器对血液中的耐药癌细胞进行敏感
直接评估患者样本在癌症治疗中具有前所未有的潜力。液体活检中的循环肿瘤细胞 (CTC) 是临床中快速发展的原发细胞来源，是实时揭示肿瘤信息的功能分析的理想候选者。然而，缺乏允许直接从液体活检样本中直接主动询问 CTC 的常规方法，这是液体活检在临床环境中转化应用的瓶颈。为了解决这个问题，我们提出了一种使用微流体涡旋辅助电穿孔系统的工作流程，该系统设计用于对从血液中纯化的 CTC 进行功能评估。通过对野生型 (HCC827 wt) 和吉非替尼耐药 (HCC827 GR6) 非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞进行药物反应分析来评估对该方法的验证。被困在微尺度涡旋中的 HCC827 细胞被电穿孔以依次将药物输送到细胞溶胶中。使用自动单细胞图像荧光强度算法，对两种细胞系的电穿孔条件进行了表征，以促进多种药物的递送。能够以高纯度收集掺入血液以模拟耐药 CTC 的 HCC827 GR6 细胞，表明该装置能够最大限度地减少下游敏感细胞检测的背景细胞影响。使用我们提出的工作流程，恢复吉非替尼敏感性的药物组合反映了预期的细胞毒性反应。总之，这些结果代表了一种微流体多药筛选面板工作流程，可以实现对患者 CTC 的原位功能询问，从而加速液体活检的临床标准化。
荧光标记的维多珠单抗可用于可视化炎症性肠病中的药物分布和粘膜靶细胞
摘要 目的 改善 IBD 患者选择和生物疗法（如维多珠单抗）的开发需要彻底了解作用机制和靶标结合，从而提供个性化的治疗策略。我们的目的是可视化静脉注射荧光标记的维多珠单抗 vedo-800CW 的宏观和微观分布，并使用荧光分子成像 (FMI) 识别其靶细胞。 设计 进行了 43 次 FMI 程序，包括内窥镜检查期间的宏观体内评估，然后进行宏观和微观体外成像。在 A 期，患者在内窥镜检查前接受 4.5 毫克、15 毫克 vedo-800CW 或无示踪剂的静脉注射。在 B 期，患者接受 15 毫克 vedo-800CW，然后接受未标记的（亚）治疗剂量的维多珠单抗。结果 FMI 定量显示炎症组织中 vedo-800CW 荧光强度呈剂量依赖性增加，15 mg（153.7 au（132.3–163.7））是最适合的示踪剂剂量，而 4.5 mg（55.3 au（33.6–78.2））则为最合适剂量（p=0.0002）。此外，在给予治疗剂量的未标记维多珠单抗后给予 vedo-800CW 时，荧光信号降低了 61%，表明炎症组织中的靶标已饱和。荧光显微镜和免疫染色显示，维多珠单抗渗透到发炎的粘膜中并与几种免疫细胞类型相关，最显著的是与浆细胞相关。结论这些结果表明 FMI 有望确定炎症靶组织中药物的局部分布并识别药物靶细胞，为靶向药物在 IBD 中的应用提供了新的见解。试验注册号 NCT04112212。
使用细胞FAD自动荧光作为无标记的细胞属性，用于产生嵌合抗原受体-T细胞
嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞疗法已成为治疗血液恶性肿瘤的一种有吸引力的方法。但是，这种疗法的可访问性受到复杂制造工艺，有限的制造设施能力以及高技能劳动力的要求，以进行CAR-T细胞生产的手动步骤。为了最大程度地减少手动过程，CAR-T细胞制造场正在向封闭和自动化系统转移，包括分析工具，可提供对生产中细胞的间歇性监测的分析工具。因此，需要在封闭系统中密切监测CAR-T细胞的无标签技术。在这里，我们评估了配备了405nm紫罗兰色激光器的流式细胞仪的使用，用于研究T细胞中NADH和FAD自动荧光。我们的结果表明，NADH和FAD自动荧光的增加与T细胞激活标记，CD25的上调显着相关，并且在T细胞激活后的头三天，在消费培养基中的细胞外乳酸的增加。我们通过建立CAR-T细胞中FAD的平均荧光强度（MFI）的变化速率与使用G-Rex Biorx Biorextor的T细胞增殖速率之间的变化速率之间的关系来确定CAR-T细胞生产的终点的潜在用途。共同表明，自动荧光，尤其是FAD自动荧光，可以用作无标记的生物标志物（细胞属性），用于监测CAR-T细胞生产过程中T细胞激活和扩张。使用405nm可见光代替了遗传毒性紫外线波长来评估NADH和FAD自动荧光，为将自动荧光测量结果铺平了一种方式，以将自动荧光测量纳入封闭和自动化的系统中，以用于对CAR-T细胞制造的过程中的监测。
bcl-xl tr-fret分析套件
图1。BCL-XL TR-FRET分析套件原理的例证。含有Terbium标记的供体，染料标记的受体，BCL-XL，肽配体和抑制剂的样品孵育180分钟。抗His标记的供体与他标记的BCl-XL结合。Bcl-XL肽配体用生物素标记，该配体允许染料标记的链霉亲和蛋白受体与Bcl-XL肽配体结合。这导致了从Terbium到受体的Terbium激发后的能量转移。使用能够TR-FRET读数的荧光板读取器测量荧光强度，而620-665 nm的增加直接对应于Bcl-XL与Bcl-XL肽配体的相互作用。背景BCl-XL（B-Cell淋巴瘤 - 巨大），也称为BCl2L1，是Bcl-2蛋白质家族的成员，参与调节细胞凋亡。bcl-XL是Bcl-2蛋白的一部分，即被认为是促生物蛋白的蛋白，就像与其效应蛋白结合时，它们会抑制细胞凋亡。bcl-XL在线粒体膜的渗透性中起作用，允许细胞色素释放C。除了其在凋亡中的作用外，它还参与了神经生长，突触可塑性和神经保护作用。顾名思义，它们在B细胞淋巴瘤中的水平异常，可能有助于该疾病的进展。BCl-XL过表达在大约80％的淋巴瘤中发现，因此在癌症治疗中是一个有吸引力的靶标。最近，它通过控制免疫细胞，成纤维细胞和其他细胞类型的凋亡率来确定为自身免疫性疾病和衰老的参与者。已经探索了几种治疗方法，靶向BCl-XL，范围从小抑制剂（例如Navitoclax）到Protac（靶向嵌合体）。Protac 753b，一种针对Bcl-XL/BCl2对VHL（Von Hippel-Lindau）的Protac，已显示出可以增加化学疗法的影响，同时避免脱靶对血小板的脱靶作用，因为这些效果不表达VHL。小型抑制剂的进步也正在进行中，并有望为肿瘤学患者带来好处。
SBFI-26 增强多西他赛治疗的三联疗法中的细胞凋亡......
摘要简介：脂肪酸结合蛋白 5 (FABP5) 在三阴性乳腺癌中表现出较高的表达水平。FABP5 的抑制剂 Stony Brook 脂肪酸结合蛋白抑制剂 26 (SBFI-26) 已证明具有抑制细胞增殖、迁移和侵袭的能力。本研究深入探讨了 SBFI-26 与多西他赛联合治疗三阴性乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的功能机制和影响。方法：选择不同浓度的多西他赛和 SBFI-26 进行单独或联合治疗。使用流式细胞术评估 SBFI-26、多西他赛或它们的组合对细胞周期停滞和细胞凋亡的影响。采用Western印迹法检测凋亡相关蛋白的表达，即半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3（Caspase3）、B细胞白血病/淋巴瘤2（Bcl- 2）和Bcl-2相关X（Bax），同时用荧光分光光度计测定细胞内活性氧（ROS）水平。结果：SBFI-26和多西他赛抑制MDA-MB-231细胞的IC50值分别为106.1μM和86.14nM。与对照组相比，联合治疗使G1期（凋亡）细胞的比例增加了3.67倍（P <0.0001）。联合组细胞凋亡率是多西紫杉醇组的 2.59 倍（ P < 0.0001），与 SBFI-26 组相比显著增加 1.82 倍（ P < 0.001）。分析显示，对于 MDA-MB-231 细胞，联合组 Bcl-2 蛋白表达降低，Bax 和 Caspase3 蛋白表达增加。此外，联合治疗组的 ROS 荧光强度是对照组的 2.97 倍（ P < 0.0001），与 SBFI-26 治疗组相比显著增加 1.39 倍（ P < 0.01），与多西紫杉醇治疗组相比显著增加 1.70 倍（ P < 0.0001）。结论：这些研究结果表明，SBFI-26 与多西他赛联合给药可通过提高细胞内 ROS 水平有效增强三阴性乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的凋亡。
TCP家族的全基因组表征及其在燕麦的非生物应激抗性中的潜在作用（Avena sativa L.）
目的：神经炎症是响应中枢神经系统（CNS）损伤，感染，毒素刺激或自身免疫性而发生的。我们先前在脂多糖（LPS）刺激下分析了HT22细胞（小鼠海马神经元）的下游分子变化。我们检测到纤维化蛋白（FBL）的表达升高，这是一种核仁甲基转移酶，但相关的促炎机制未被系统地阐明。这项研究的目的是研究FBL影响神经炎症的潜在机制。方法：使用RT实时PCR，蛋白质印迹和免疫荧光来评估用LPS刺激的HT22细胞中FBL的mRNA和蛋白质表达，以及FBL的细胞定位和荧光强度。Bay-293（七个无同源物1（SOS1）抑制剂的儿子），SR11302（激活蛋白-1（AP-1）抑制剂）和KRA-533（KRAS激动剂）用于确定FBL效果的潜在的分子机制。ap-1是FBL的靶蛋白，并用T-5224（AP-1抑制剂）进行验证。另外，通过转录组测序鉴定了FBL的下游信号通路，并通过RT-real-eal-time PCR验证。结果：LPS在HT22细胞中诱导FBL mRNA和蛋白质表达。深入的机械研究表明，当我们抑制C-FOS，AP-1和SOS1时，FBL表达降低，而当使用KRAS激动剂时，FBL表达会增加。本研究揭示了FBL促进神经炎症的机制，并为治疗神经炎症提供了潜在的靶标。此外，在FBL过表达后，将NF-KB信号通路中炎症基因的转录水平（包括CD14，MyD88，TNF，TRADD和NFKB1）升高。结论：LPS通过RAS/MAPK信号通路诱导HT22细胞中FBL的表达，FBL进一步激活了NF-KB信号通路，从而促进了相关炎症基因的表达和细胞因子的释放。关键字：FBL，神经炎症，LPS，分子对接，转录组测序
SBFI-26增强了多西他赛处理的三重...
摘要简介：脂肪酸结合蛋白5（FABP5）在三阴性乳腺癌中表现出较高的表达水平。Fabp5的抑制剂，Stony Brook脂肪酸结合蛋白抑制剂26（SBFI-26），已经证明了抑制细胞增殖，迁移和侵袭的能力。这项研究深入研究了将SBFI-26与多西他赛在三阴性乳腺癌的MDA-MB-231细胞中结合的功能机制和影响。方法：选择各种多西他赛和SBFI-26的浓度用于个体或联合治疗。使用流式细胞术评估了SBFI-26，多西他赛或它们对细胞周期停滞和凋亡的组合的影响。Western印迹用于检测与凋亡相关蛋白的表达，即白菜天冬氨酸特异性蛋白酶3（CASPASE3），B细胞白血病/淋巴瘤2（BCL-2）（BCl-2），BCl-2相关X（BAX），而固醇反应性氧化物（BAX）则使用了反应性氧化物（Ros）spection（Ros）水平。结果：抑制MDA-MB-231细胞中SBFI-26和多西他赛的IC50值分别为106.1μm和86.14 nm。显着，与对照组相比，联合处理的组合治疗将G1相（凋亡）细胞的比例增加了3.67倍（P <0.0001）。此外，组合组的凋亡率比多西他赛组（p <0.0001）高2.59倍（P <0.0001），与SBFI-26组相比显示出1.82-倍的显着增加（p <0.001）。分析显示，Bcl-2的蛋白质表达降低，而BAX和CASPASE3的MDA-MB-231细胞组合组显示出增加。此外，与对照组相比，与对照组相比，合并的治疗组的ROS荧光强度增长了2.97倍（P <0.0001），值得注意的1.39倍（P <0.01），与SBFI-26治疗组相比，与Doceetaxel治疗组相比，与SBFI-26治疗组相比增加了1.39倍（P <0.01）。结论：这些发现表明，SBFI-26与多西他赛的共同给药有效地增强了三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞中的凋亡，通过升高细胞内ROS水平。
混合0D锑卤化物作为高空间分辨率远程热摄影的空气稳定发光体
上个世纪的快速技术进步导致温度传感领域中带来了新的Challenges。准确，遥远，无接触式和实时微观和纳米级的温度映射在细胞成像，微流体和纳米流体以及集成电路设计中的需求巨大，[1-11]中，这些严格的要求需要使用光学方法。这些通常分为三个主要的猫：红外（IR）隆期，IR直接检测和远程光学/荧光热量表。，由于其出色的热分辨率（10-1 K），其中最常见的是IR射量方法，例如在商业设备中发现的方法。然而，要检测到的黑体辐射的长红外波长导致室内温度（RT）对象的固有低空间分辨率为≈10µm，这是由于abbe差异的限制所期望的。对IR光的检测也遭受了由于吸收而缺乏与广泛的光学成分相兼容。[12,13]或者，在可见区域中运行的远程光学方法，例如，通过测量荧光强度或衰减时间，[14]达到了很高的热分辨率，并且可能由于较低的衍射极限而有可能提供较高的空间分辨率，并且在常见媒体（例如水和玻璃）中透明度。[13,15,16]基于强度的量化，由于光散射（样品拓扑，磷光粒子形态等）而容易出现错误。），不均匀的磷光器分布，非态磷光物种形成或批处理变异性等。虽然基于荧光时代的热量成像是继承了许多此类局限性，但其部署通常会因适合特定应用的特定要求的磷剂的可用性而受到阻碍。我们的本文提出的研究涉及在RT周围温度下在温度下进行高空间和热分辨率热图形的新型热液少量探索。在这种情况下，我们发现已知的热燃料载体，即有机染料，聚合物，量子点，稀有掺杂的金属氧化物，[17-25]面临限制，例如材料制造或薄膜沉积，耐用性和健壮性的耐用性和稳健性的耐磨性，或者不适合特定范围的特定方法或常见的特定方法。