aptiva乳糜泻IgG试剂盒包含两个不同的颗粒群。一个涂有重组组织转基谷氨酰胺酶抗原的颗粒和一个涂有合成脱膜麦醇溶蛋白肽的颗粒,另一种涂有山羊抗人IgG抗体的额外的第三个颗粒作为对照验证。Aptiva系统稀释了患者样本1:23,然后将等分的稀释患者样品和试剂组合成比色杯。混合物在37°C下孵育。在洗涤周期后,将共轭抗人IgG抗体添加到颗粒中,并在37°C下孵育该混合物。在另一个洗涤周期中除去过量的共轭物,并将颗粒重新悬浮在系统流体中。系统生成多个图像以识别和计算两个唯一的分析物粒子,并确定每个粒子上的共轭量。第三个粒子涂有山羊抗人IgG抗体,是在试剂中存在的,作为对照在样品中标记低浓度IgG的对照,作为测定验证步骤。每个分析物的中位荧光强度(MFI)与与人IgG结合的共轭物的浓度成正比,这与与相应粒子区域结合的IgG抗体浓度成正比。系统使用每个区域的至少50个颗粒的MFI。颗粒的身份取决于颗粒的独特特征。Aptiva腹腔疾病IgG试剂中的每个分析物被分配为预定义的批次特定主曲线。v实质性等价信息:谓词设备名称:分析物特定的主曲线存储在试剂墨盒RFID标签上(射频标识)。基于运行校准器获得的结果(单独提供),该系统创建了特定于仪器的工作曲线。工作曲线从每个样品获得的MFI值中计算每个分析物的荧光单元(流感)。基于每个分析物的定义截止值,每个样品的测试结果均为“正”或“阴性”,每种测定的FLU的测试值,即DGP IgG和TTG IgG。
使用1。通过编写灭菌器编号(如果有多个),标签上的负载号和处理日期来识别Bionova®BT225SCBI。2。根据建议的灭菌做法,将SCBI和材料一起在适当的包装中进行灭菌。将包装放置在那些被认为是绝育剂最无法获得的区域(例如,负载中心和门附近的区域)。3。照常消毒。4。灭菌过程完成后,打开灭菌器门,等待五分钟,然后从包装中删除SCBI。注意:从灭菌包装中卸下Bionova®BT225SCBI时,戴上安全眼镜和手套。警告:不要过度压碎或处理SCBI,因为这可能会导致玻璃安培破裂。5。让SCBI冷却直至达到室温。6。检查SCBI标签上的过程指标。向棕色的颜色变化表明SCBI已暴露于蒸汽中。重要:这种颜色变化没有证明实现无菌性的过程有效性。如果过程指示器颜色尚未更改,请检查灭菌过程。7。按盖子密封管子。将SCBI中包含的Amboule粉碎,上面装有单个Ampoule碎碎机或放置在Bionova®Photo-PhotoN®自动阅读器孵化器(BPH)后面的Ampoule破碎机。然后剧烈摇动管子,直到介质到达管的底部并完全浸泡孢子载体。孢子载体的不完全润湿可能导致荧光读数不正确。最后,将SCBI放在孵化器中。重要:在运行灭菌周期时,至少每天至少每天使用一次非杀菌的SCBI作为阳性对照。阳性控制可确保满足正确的孵化条件;培养基促进快速增长的能力;孢子活力并未因储存温度,湿度或靠近化学物质以及Bionova®Photon®自动读取器孵化器(BPH)的正常功能而受到损害。,正面对照指标和处理后的指示器应属于同一批次。8。在Bionova®Photon®自动读取器孵化器(BPH)中,在60±2°C下孵育处理的生物学指标和阳性对照指标,以进行7秒钟,以进行即时荧光读数。注意:灭菌和孵育之间的时间不应超过7天的时间。由自动阅读器(激发340-380 nm /发射455-465 nm)检测到的荧光强度,孵育7秒后决定了消毒过程的效率。阳性对照必须给出正荧光读数,以使结果有效。记录阳性结果并立即丢弃SCBI,如下所示。
6 Centro de Investigación de Estudios Avanzados del Maule, Universidad Católica del Maule, 3480112 Talca, Chile Oocyte maturation or the acquisition of meiotic competence requires a controlled expression of proteins that supports this process in preparation for fertilization.两者均由高度调节的离子稳态确定卵母细胞的成熟和受精。几个离子通道,调节多种细胞过程,据报道在包括哺乳动物在内的不同物种的卵中表达。受精始于成熟卵母细胞中的精子 - 特异性磷脂酶(PLC)。Ca 2+流入需要在卵母细胞中积聚Ca 2+以准备受精,并在受精过程中补充其细胞内存储,从而支持Ca 2+振荡和卵子激活。卵子激活包括在其他过程之间形成前核,皮质颗粒外胞菌病,多植物的封闭性和减数分裂II,以支持向早期胚胎发育过渡的其他过程。电压门控活化的钙通道Cav3.2通道已被表达,并有助于对钙储存的补充,以准备小鼠卵中的受精。此外,已经显示出在小鼠卵中表达的阳离子非选择性通道TRPV3的瞬态受体通道TRPV3(一种阳离子非选择性通道),但是其生理功能目前尚不清楚。在这里,我们表明TRPV3和CAV3.2在小鼠卵中功能相互作用。使用缺乏TRPV3和CAV3.2蛋白的卵,我们评估它们在皮质颗粒分布中的作用。方法:使用KO动物模型,共焦显微镜,生物信息学和斑块钳电生理学,我们测试了离子通道在小鼠卵中的表达和功能,并评估了它们在皮质颗粒动力学中的作用。结果:TRPV3KO卵中的Cav3.2 -20 mV时的Cav3.2电流显着降低(8pa/pf wt卵,trpv3ko卵中的3,75 pa/pf)。TRPV3电流(41 pa/pf在wt中为41 pa/pf,而在cav3.2ko卵中的30,5 pa/pf)。trpv3ko卵显示,与WT卵相比,标记为透镜culinaris凝集素的荧光强度测量的质膜中的CG密度显着降低。生物信息学方法揭示了CAV3.2和TRPV3蛋白之间物理相互作用的可能位点/残基。我们的结果表明,Cav3.2和TRPV3的功能和/或物理相互作用可能将关键细胞过程调节为皮质颗粒分布,在哺乳动物中卵向胚胎过渡的基础。致谢:Fondecyt 1221308; Fondequip Anid EQM200122
多个PEG链的水合体积。TX100是一种表面活性剂,具有乙氧基甲氧基辛基的基本骨架,带有一个亲水头和一个疏水性尾巴的长矛状结构。使用荧光光谱法检查了表面活性剂与模型抗原之间的相互作用,据说这比UV-VIS光谱,5和NMR光谱谱比敏感性高1000倍,该光谱具有与UV-VIS光谱的敏感性相当的敏感性。牛血清白蛋白(BSA)长期以来一直详细研究了溶液中的抗原性和抗原性,被选为模型抗原。6,7我们还专注于环糊精(CD)作为抗原疏水核心的通用模型,因为长期以来一直将CD作为酶的底物结合位点的模型研究,从1954年的Einschlussverbindunger(包含化合物)出版。8有一些使用CD衍生物作为氧化酶和酯酶模型的例子。9,10最近,据报道CD衍生物是脂肪酶的模型,这些脂肪酶可以选择性地水解疏水腔中的溶血磷脂。11因此,CD在历史上被认为是酶的底物结合位点的模型,这是外部疏水物质界面的典型示例,并探索辅助表面活性剂在其上的作用如何被认为是理想的实验系统,可以普遍地模拟蛋白质的疏水核心核心核心。在这项研究中,在环脱糖蛋白中选择了羟丙基-B-环糊精(HP-B -CD),该研究具有明确定义的疏水性和疏水性表面,并最大程度地显示了疏水性荧光探针的荧光(见下文)。使用特定的蛋白质,例如BSA,卵蛋白(OVA)和核糖核酸酶(RNase)作为抗原模型,不允许我们摆脱其独特的特性,12并利用CD作为抗原核心核心的模型,可以为这个问题提供解决方案。通过评估疏水性荧光探针与模型抗原疏水性核心的吸附和结合,评估了各种非离子表面活性剂与模型抗原BSA和HP -B -CD模型抗原之间的相互作用。The hydrophobic core environment of BSA and HP- b -CD was evaluated by the fluorescence of 8-anilinonaphthalene-1- sulfonic acid (ANS), a hydrophobic fluorescent probe whose fluorescence is enhanced in hydrophobic environments or adsorbed in the lipid bilayer of liposomes, in the hydrophobic core of proteins, 13–17 or in the表面活性剂的胶束。18因此,ANS用于评估这些大分子和小分子提供的疏水环境。然而,一定浓度后,ANS和其他荧光分子的荧光强度开始降低。这称为浓度猝灭,由于内部滤波器效应,它被广泛称为淬火。19其他可能的淬火机制包括forster共振能量转移(FRET)和DEXTER机制,20,21是由荧光分子彼此接近造成的。无论机制如何,荧光分子数量增加引起的淬火是评估中培养基和大分子提供的疏水环境的障碍。为了解决这个问题,我们在本研究中利用了抑制剂模型。
图1创建合成cAMP响应元件结合蛋白(CREB)响应启动子。(a)腺苷信号传导的描述。腺苷(红色球)结合腺苷受体A2AR/A2BR,该腺苷受体动员相关的G蛋白(绿色)激活腺苷酸环化酶(橙色受体),并将ATP转化为3'5'- 5'-循环腺苷单磷酸腺苷(Camp)。另外,福斯科蛋白(橙色球)可以直接激活腺苷循环酶。CAMP结合蛋白激酶A(PKA)与磷酸化的CREB,该CREB结合了Plindromic DNA基序“ TGACGTCA”,激活了基因表达。(b)启动子设计和筛选示意图。cAMP响应元件基序(CRE,突出显示的黄色)被克隆在3倍重复中,两侧是鸟嘌呤“ G”(带下划线),六个散布的填充核苷酸(N)。3x Cres(灰色正方形)放在核心启动子(蓝色箭头)上游的1-6个重复中。用高斯荧光素酶(GLUC)或绿色荧光蛋白(EGFP)定量启动子活性。(c,d)HEK293T细胞在96个井板中用指示的构建体(x轴)反向转染。转染后48小时,用车辆(DMSO,浅蓝色条)或20μm福斯科林(FSK,深蓝色条)将细胞介质更改为培养基。八个小时后,对培养基进行了采样并测试了GLUC活性(RLU)。条表示n = 3实验重复的平均值,误差线代表标准误差(SEM)。**通过方差分析(ANOVA)Tukey检验,与所有其他样本相比,表示P <0.01。(E,F)流式细胞仪启动子诱导。HEK293T细胞用96个井板中的指定构建体(x轴)反向转染。转染后48小时,细胞培养基被更改为未处理的培养基(浅蓝色条),或补充了0.750 m m m腺苷(ADO,深蓝色条)的培养基。八个小时后,将细胞胰蛋白酶胰蛋白酶进行胰蛋白酶,并将其重悬于FACS缓冲液中以进行流式细胞仪。y轴表示正向散射(FSC)单元的EGFP中位荧光强度。条代表n = 3实验重复的平均值,误差线代表SEM。(g)启动子对腺苷的剂量反应性。HEK293T细胞在96个井板上反向转染,并在传说中指示的构造,然后培养48小时。然后更改培养基以添加不同的腺苷浓度,在8小时后进行采样,并测试了GLUC活性(RLU)。**通过12倍-CRE_YB的ANOVA TUKEY测试代表P <0.01,与1 m m的所有其他样品相比。每个点表示n = 3实验重复的平均值,误差线为SEM。