图1。基于质粒的CRISPR敲入的高度提高的克隆效率:(a)泳道1:NEB®DNA梯子标准(N3200S);泳道2:标准NEB®Q5PCR方案30个周期的Q5 PCR方案基于光涂抹和〜300bp的额外不需要的PCR产物导致过多的DNA,可重复出现30个周期。车道3-8:优化PDD162扩增的PCR循环编号。基于此数据,我们选择了15个周期作为PDD162所有后续扩增的最佳数字。(b)过多的PCR产物和DPNI消化不足会导致约35%的KLD连接克隆是错误的CAS9/SGRNA质粒。相反,优化PCR和KLD连接反应会导致90%的克隆具有正确的GRNA插入。(c)载体主链和用于