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酵母模块化克隆工具包的扩展，用于基于 CRISPR 的应用、基因组整合和组合文库
摘要：在过去的几十年中，遗传部件的标准化已成为一个越来越受关注的话题。为了简化分子克隆程序，同时使其更可预测和可重复，人们设计了几种生物标准，其中之一就是模块化克隆 (MoClo)。酵母 MoClo 工具包提供了一个大型特征化遗传部件库，并结合了全面而灵活的组装策略。在这里，我们的目标是 (1) 通过提供一个简单的设计工具将新部件纳入 MoClo 库来简化标准的采用；(2) 通过展示启动子部件中的 BglII 位点对蛋白质表达的影响来进一步表征工具包；(3) 扩展工具包，以便高效构建 gRNA 阵列、无标记整合盒和组合库。这些新增功能使工具包更适用于常见的工程任务，并将进一步促进其在酵母生物工程界的采用。关键词：酿酒酵母，工具包，模块化克隆，gRNA 阵列，基因组整合，文库构建■ 简介
Invitrogen™ LentiArray™ 人类 CRISPR 文库，96 孔...
转导条件 • 您必须根据经验确定每种细胞系的转导条件和感染复数 (MOI)。如果需要共感染，我们建议对 Cas9 至 CRISPR 文库慢病毒颗粒使用 5–10 的 MOI 比率，以达到最佳基因敲除程度。 • 感染期间使用含较低水平 FBS（例如 3– 5% FBS）的培养基可能会增加某些细胞类型的转导效率。 • Polybrene™（六甲溴铵）可以将慢病毒转导到人细胞的效率提高 2–10 倍。您必须根据经验确定目标细胞的最佳 Polybrene™ 浓度（例如最大感染性，最小毒性）。我们建议使用浓度范围（2–8 µg/mL）对 Polybrene™ 耐受性进行初步测试。 • 如果您计划使用嘌呤霉素进行选择，则必须首先确定选择转导细胞所需的最佳嘌呤霉素浓度。抗生素批次、细胞类型、细胞生长动力学和细胞培养条件（包括细胞密度）会影响筛选所需的嘌呤霉素量。使用嘌呤霉素进行筛选通常需要 7-10 天。
Twist Bioscience 文库制备和靶标富集检测试剂盒是一款高度模块化的靶标富集下一代测序 (NGS) 试剂盒，具有
Twist Bioscience 文库制备和靶向富集检测是一种高度模块化的靶向富集下一代测序 (NGS) 试剂盒，具有从固定面板到全外显子组测序的各种应用。该试剂盒利用基因组 DNA (gDNA) 的片段化、连接和扩增来制备 NGS 文库，并利用基于珠子的杂交文库捕获来富集文库。Twist Bioscience 为用户提供了高度的灵活性，以满足实验室的需求，包括酶促或机械片段化、使用 Twist 全长组合双 (CD) 索引适配器或通用双索引 (UDI) 引物的两组不同的索引化学反应、单重或多重富集选项、用于文库富集的市售固定面板和定制面板选项，以及“标准”16 小时杂交选项或可运行 15 分钟至 4 小时的“快速”杂交选项。整个手动文库制备和靶向富集方案可以在最短一天或最多三天内完成。
嵌合末端标记（METa）组装技术高效构建功能性宏基因组文库
摘要 功能性宏基因组文库是一种物理细菌文库，可以高通量捕获和表达微生物组基因，在无需测序和不依赖培养的宏基因组探索中发挥了重要作用。然而，这些文库的制备往往受到其高 DNA 输入要求和低克隆效率的限制。在这里，我们描述了一种新方法，即镶嵌末端标记 (METa) 组装，用于高效的功能性宏基因组文库制备。我们将标记技术应用于来自土壤和肠道微生物组的宏基因组 DNA，以制备 DNA 插入物，从而高通量克隆到功能性宏基因组文库中。所得 DNA 片段中镶嵌末端序列的存在与基于同源性的组装克隆协同作用，使克隆效率与传统的基于平头克隆的协议相比提高了 300 倍。我们表明，与使用最新协议制备的已发表文库相比，METa 组装的效率平均高出约 20 到 200 倍，只需 200 ng 输入 DNA 即可制备千兆碱基大小的文库。我们首先通过使用标准 5 mg 质量的土壤宏基因组 DNA 制备出一个 700 Gb 的文库来展示 METa 组装的实用性，这使得我们发现了新的诺尔丝菌素抗性基因和一种潜在的新抗性模式；其次通过使用仅 300 ng 的鹅粪便宏基因组 DNA 制备出一个 27 Gb 的文库，该文库捕获了大量四环素和粘菌素抗性基因。METa 组装为制备功能性宏基因组文库提供了一种简化、灵活且有效的方法，为低生物量或稀缺微生物组的遗传和生化研究开辟了新途径。
通过全激酶组 CRISPR-Cas9 文库系统筛选骨肉瘤的潜在治疗靶点
摘要 目的：骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，但由于缺乏有效的治疗靶点，骨肉瘤患者的生存期在过去 30 年中一直保持不变。方法：构建了包含 507 个激酶和 100 个非靶向对照的激酶组靶向 CRISPR-Cas9 文库，并筛选了骨肉瘤中潜在的激酶靶点。使用基于模型的全基因组 CRISPR/Cas9 敲除分析 (MAGeCK) Python 包分析 CRISPR 筛选测序数据。通过 lenti-CRISPR 介导的基因敲除将功能数据应用于 143B 细胞系。在 R2：基因组学分析和可视化平台中分析激酶在骨肉瘤患者生存中的临床意义。结果：我们确定了骨肉瘤中的 53 个潜在激酶靶点。在这些靶标中，我们分析了 3 种激酶，TRRAP、PKMYT1 和 TP53RK，以验证它们在骨肉瘤中的致癌功能。PKMYT1 和 TP53RK 在骨肉瘤中的表达高于正常骨组织，而 TRRAP 无明显差异。所有 3 种激酶的高表达与骨肉瘤患者的预后相对较差有关。结论：我们的研究结果不仅提供了骨肉瘤中潜在的治疗激酶靶标，而且还为使用 CRISPR-Cas9 文库进行功能性遗传筛选提供了范例，包括靶标设计、文库构建、筛选工作流程、数据分析和功能验证。该方法还可能有助于加速其他类型癌症的药物发现。关键词骨肉瘤；激酶；CRISPR-Cas9 文库；TRRAP；PKMYT1；TP53RK
SMOOT 文库和噬菌体诱导的 Cas9 定向进化可减少脱靶活性
RNA 引导的核酸内切酶（如 Cas9）可在细胞中提供有效的靶向基因组编辑，但也可能切割整个基因组中的脱靶位点。化脓性链球菌 Cas9 (SpCas9) 的工程变体已被开发出来以全面降低脱靶活性，但个别脱靶可能仍然存在，或者靶向活性可能受到损害。为了在保持强大的靶向编辑的同时对抗特定脱靶的活性，我们开发了一种新颖的 M13 噬菌体介导选择方法。使用这种方法，连续几轮正向和负向选择用于识别增强或减弱特定基因组序列编辑活性的 Cas9 突变。我们还引入了寡核苷酸定向靶标扫描诱变 (SMOOT)，这是一种全面的诱变方法，用于创建高度多样化的 Cas9 变体库，这些库可以通过基于噬菌体的选择进行挑战。我们的平台识别出新的 SpCas9 突变体，这些突变体在生化测定和 T 细胞中减轻了对脱靶的切割，同时保持了比以前描述的变体更高的靶向活性。我们描述了一种进化的变体，S . pyogenes Adapted to Reduce Target Ambiguity Cas9 (SpartaCas)，它由最丰富的突变组成，每个突变的功能未知。这种进化的 Cas9 突变体减少了脱靶切割，同时保留了对多个治疗相关靶标的有效编辑。使用我们的系统对 Cas9 进行定向进化展示了一种改进的结构独立方法，可以有效地设计核酸酶活性。
采用酶促碎裂法制备文库所得的测序产物
DNA 片段化是基于杂交捕获的短读测序中文库制备过程中的一个基本步骤。迄今为止，人们一直使用超声波来制备适当大小的 DNA，但这种方法会导致大量 DNA 样本损失。最近，研究采用了依赖于 DNA 内切酶酶促片段化的文库制备方法来最大限度地减少 DNA 损失，尤其是在纳米量样本中。然而，尽管它们被广泛使用，但酶促片段化对所得序列的影响尚未得到仔细评估。在这里，我们对使用超声波和酶促片段化方法制备的相同肿瘤 DNA 样本的体细胞变异进行了成对比较。我们的分析显示，与通过超声波创建的文库相比，内切酶处理的文库中反复出现的人工 SNV/indel 数量要多得多。这些人工制品以基因组背景下的回文结构、测序读取中的位置偏差和多核苷酸替换为标志。利用这些独特的特性，我们开发了一种过滤算法，可以高特异性和灵敏度地区分真正的体细胞突变和人为噪声。噪声消除恢复了肿瘤样本中突变特征的组成。因此，我们提供了一种信息学算法来解决因内切酶介导的碎片化而产生的测序错误，这是本研究中首次强调的。