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碱基编辑业务：从实验室到临床的演变
AU：请确认所有标题级别均正确表示：随着 20 世纪 70 年代重组 DNA 技术的出现，使用基因疗法治疗人类遗传疾病的想法引起了世界各地科学家的兴趣和想象。多年后，主要得益于基于 CRISPR 的基因组编辑工具的开发，该领域呈爆炸式增长，学术实验室、初创生物技术公司和大型制药公司齐心协力开发改变生活的治疗方法。在本文中，我们重点介绍碱基编辑技术及其从实验室到临床的发展。碱基编辑于 2016 年首次报道，能够将 C•G 安装到 T•A 和将 A•T 安装到 G•C 点突变，同时在很大程度上避免了传统 CRISPR/Cas9 基因编辑的一些缺陷。尽管这些技术还很年轻，但它们已被学术实验室和治疗公司广泛使用。在这里，我们概述了碱基编辑的机制及其在临床试验中的应用。
使用碱基编辑器进行精确的基因组编辑
摘要：单核苷酸变异约占人类已知致病遗传变异的一半。通过逆转致病点突变且副作用最小的基因组编辑策略具有巨大的治疗潜力，目前正在被积极推行。碱基编辑和主要编辑等精准高效的基因组编辑策略的出现为核苷酸转换提供了强有力的工具，而不会诱导双链 DNA 断裂（DSB），这在治疗遗传疾病方面显示出巨大的潜力。人们开发了各种各样的碱基编辑器工具包，以提高不同应用环境中的编辑效率和准确性。本文，我们总结了碱基编辑器（BE）的发展、它们的局限性以及基于碱基编辑的治疗策略的未来前景。
使用 SNAP- 进行精确高效的 C-to-U RNA 碱基编辑...
定点 RNA 碱基编辑能够实现遗传信息的瞬时和可控改变，代表了一种操纵细胞过程的最新策略，为新型治疗方式铺平了道路。虽然已经对引入腺苷到肌苷变化的工具进行了深入研究，但对胞苷到尿苷编辑的精确和可编程工具的工程设计却有些落后。在这里，我们证明，从 RESCUE-S 工具中获取的 ADAR2 腺苷脱氨酶进化而来的胞苷脱氨酶结构域在将 RNA 靶向机制从基于 Cas13 更改为基于 SNAP 标签时提供了非常高效且高度可编程的编辑。向导 RNA 化学的优化进一步允许在难以编辑的 5'-CCN 序列环境中显着提高编辑产量，从而提高了该工具的底物范围。关于编辑效率，SNAP-CDAR-S 在所有测试目标上都明显胜过 RESCUE-S 工具，并且在扰乱 β-catenin 通路方面也非常出色。 NGS 分析表明，这两种工具都存在类似、适度的全局脱靶 A 到 I 和 C 到 U 编辑。
利用胞嘧啶碱基编辑进行 CRISPR-Cas 引导的福氏志贺氏菌染色体和毒力质粒诱变
摘要 志贺氏菌是一种革兰氏阴性细菌，可侵入人体肠道上皮。由此引起的感染志贺氏菌病是最致命的细菌性腹泻病。有关决定志贺氏菌病理生理的基因（包括染色体和毒力质粒）的大部分信息都是通过经典反向遗传学获得的。然而，流行的诱变技术的技术限制使得单次反应中只能产生少量突变体，从而阻碍了大规模的志贺氏菌靶向诱变和随后的表型评估。我们采用了一种 CRISPR-Cas 依赖性方法，其中切口酶 Cas9 和胞苷脱氨酶融合在单向导 RNA（sgRNA）的引导下引入靶向 C ！ T 转换，导致内部终止密码子和翻译过早终止。在使用 mCherry 荧光报告基因的原理验证实验中，我们能够在大肠杆菌和志贺氏菌中生成功能丧失突变体，效率高达 100%。使用改进的波动分析，我们确定在优化条件下，由 Cas9 脱氨酶融合引入的非靶向突变的频率与自发突变在同一范围内，这使我们的方法成为细菌诱变的安全选择。此外，我们对该方法进行了编程，以突变已充分表征的染色体和质粒携带的志贺氏菌基因，并发现突变体的表型与已报道的基因缺失突变体的表型相似，在表型水平上没有明显的极性效应。该方法可用于 96 孔板格式，以提高通量并在几天内生成一系列靶向功能丧失突变体。
使用 CRISPR 碱基编辑器在 DNA 磁带上进行数字数据存储
摘要：尽管档案数字存储行业已接近其物理极限，但需求却在大幅增长，因此出现了替代产品。最近的努力已经证明了 DNA 作为数字存储介质的巨大潜力，具有卓越的信息耐久性、容量和能耗。然而，大多数提出的系统都需要按需从头 DNA 合成技术，这些技术会产生大量有毒废物，因此不具备工业可扩展性和环保性。受半导体存储设备架构和基因编辑最新发展的启发，我们创建了一种称为“DNA 突变覆盖存储”（DMOS）的分子数字数据存储系统，该系统通过利用组合、可寻址、正交和独立的体外 CRISPR 碱基编辑反应来存储信息，将数据写入绿色合成 DNA 磁带的空白池中。作为概念验证，我们在 DNA 磁带上写下了我们学校徽标的位图表示和本研究的标题，并准确地恢复了存储的数据。
CRISPR/Cas9介导的碱基编辑在植物育种中的应用及前景
摘要：成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/相关蛋白9系统（Cas9）已被广泛用于优化种质资源的多个方面。然而，大规模基因组研究表明，农作物的新变异归因于单核苷酸多态性（SNP）。因此，将单个碱基替换到植物基因组中可能会产生理想的性状。通过CRISPR / Cas9技术进行的基因编辑经常导致插入-缺失（indel）。碱基编辑可以在没有双链断裂（DSB）和供体修复模板（DRT）的情况下在基因组中实现精确的单核苷酸改变。因此，BE提供了一种关于基因组编辑的新思路，碱基编辑技术目前正在用于编辑许多不同生物的基因组。随着传统育种技术和现代分子育种技术的相互补充，各种基因组编辑技术应运而生。如何发挥 BE 应用的更大潜力是我们需要考虑的问题。本文，我们介绍了 CBE、ABE 和 CGBE 等各种碱基编辑。此外，还总结了碱基编辑技术在农业中的最新应用，包括作物产量、品质、疾病和除草剂抗性。最后，介绍了碱基编辑技术的挑战和未来前景。旨在全面概述 BE 在作物育种中的应用，以进一步改进 BE 并最大限度地发挥其价值。
碱基编辑作为脊髓性肌萎缩症的基因治疗方法
图 1. 开发腺嘌呤碱基编辑来纠正 SMN2 外显子 7 C6T。a、未受影响个体和脊髓性肌萎缩症 (SMA) 患者的 SMN1 和 SMN2 示意图。SMN1 中的突变会导致 SMA，因为 SMN 蛋白会消耗，而这可以通过编辑 SMN2 来恢复。b、与 SMN1 相比，SMN2 外显子 7 C 到 T (C6T) 多态性的示意图，其中有碱基编辑器 gRNA 靶位及其估计的编辑窗口。cd、当使用由腺嘌呤脱氨酶结构域 ABEmax 33,38、ABE8.20m 35 和 ABE8e 36 与野生型 SpCas9（面板 c）或 SpRY 37（面板 d）融合的 ABE 时，对 SMN2 C6T 靶向腺嘌呤和其他旁观者碱基进行 A-to-G 编辑，通过靶向测序进行评估。 e，使用 SpRY 或其他宽松 SpCas9 PAM 变体 43 对 SMN2 外显子 7 中的腺嘌呤进行 A 到 G 编辑，通过靶向测序进行评估。图 ce 中的数据来自 HEK 293T 细胞中的实验；n = 3 个独立生物学重复的平均值、sem 和单个数据点。
枯草芽孢杆菌高效双碱基编辑平台的构建及应用
构建进化的细菌底盘通常依赖于功能蛋白的定向进化。1 进化的蛋白质替代宿主中的天然对应物，从而形成具有特定表型的进化细菌底盘，2 例如大肠杆菌中进化的RpsE和酵母中的PfDHFR分别赋予壮观霉素抗性 3 和乙胺嘧啶抗性 4。然而，外源DNA的替代会影响宿主的安全性，这限制了宿主在某些领域的应用，特别是在食品工业中。因此，期望宿主自身的蛋白质得到进化。蛋白质定向进化的技术框架已经从体外发展到体内。5 – 7 定向进化的典型策略是随机诱变、半理性设计和理性设计。它们都严重依赖于从基因克隆、体外诱变、异源或整合的几个迭代步骤的过程
推出 CRISPR/Cas9 胞嘧啶碱基编辑器工具箱“LeishBASEedit”——无需 DNA 双链断裂、同源重组或供体 DNA 即可对利什曼原虫进行基因编辑和高通量筛选
。CC-BY-NC 4.0 国际许可证永久有效。它是在预印本（未经同行评审认证）下提供的，作者/资助者已授予 bioRxiv 许可，可以在该版本中显示预印本。此版本的版权持有者于 2022 年 12 月 8 日发布。；https://doi.org/10.1101/2022.12.08.519658 doi：bioRxiv 预印本
ESCAPE-2：配对 HSC CD117 表位工程和通过碱基编辑直接编辑镰状等位基因，用于抗体介导的自体 HSC 治疗 c
通过碱基编辑在人类β珠蛋白基因 ( HBB ) 中引入天然存在的 Hb G-Makassar 变异，以消除聚合镰状蛋白 HbS（镰状细胞性贫血的主要分子驱动因素），这代表了治疗这种疾病患者的潜在新模式。虽然临床上正在推进几种用于治疗镰状细胞性贫血的体外基因编辑技术，但这种具有潜在变革性的细胞疗法仍然存在一些挑战，即在自体造血干细胞移植 (HSCT) 之前必须进行基因毒性骨髓清除性预处理。为了解决这个问题，我们开发了一种策略，即将一种与 CD117 结合的单克隆抗体 (mAb) 与多重工程化 HSC (eHSC) 结合，CD117 是 HSPC 上对生存至关重要的关键受体。我们的 eHSC 旨在逃避 mAb 结合并携带 Makassar 治疗性编辑。我们的工程干细胞抗体配对逃避（ESCAPE）策略旨在为当前的预处理方案提供一种非基因毒性的替代方案。