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由于双重SAMDH1突变而引起的三名患有AICARDI-GOUTIères综合征的三名患者的诱导多能干细胞系
aicardi-gouti` eRes综合征（AGS）是一种系统性的炎症性疾病，并且在婴儿早期开始时（Aicardi and Goutieres，1984）。患者通常患有白细胞症状，其特征是易怒，肌张力障碍，癫痫发作和发烧，导致严重的发育延迟和小头畸形。脑成像显示基底神经节钙化和进行性脑萎缩。ags模仿子宫内获得的病毒感染。一些患者会出现自身免疫性疾病全身性红斑狼疮患者的体征，包括肝炎，血小板细胞减少症，抗核抗体以及皮肤恐龙病变（Ramantani等，2010）。淋巴细胞增多症和抗病毒细胞因子干扰素（IFN）-α在脑脊液中通常在疾病病程初期观察到。全身激活I型IFN，如外周血细胞中IFN刺激的基因的上调所示（也称为IFN信号）通常可以连续检测到。ags是一种由至少九种不同基因（AGS1-AGS9）突变引起的遗传异质性疾病，该疾病在核酸代谢和免疫识别的过程中起作用（Crow and Stetson，2022）。在这项研究中，使用无整合的仙台病毒方法来重新编程源自皮肤活检或外周血单核细胞（PBMC）的成纤维细胞（来自SAMHD1中的常染色体隐性突变（AGS5）的三名AGS患者（AGS5）（AGS5）（Rice等，2009）。SAMHD1编码SAM结构域和含HD结构域的蛋白1，一种依赖于DGTP的三磷酶氢化酶，将脱氧核苷Tri磷酸盐（DNTPS）转换为组成型脱氧核苷和甲磷酸甲磷酸盐。SAMHD1缺乏会导致内部lular DNTP池失衡，导致基因组不稳定性（Kretschmer等，
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较平均 mtDNA 拷贝数
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较样本的平均 mtDNA 拷贝数。大鼠 mtDNA 引物组可识别并扩增大鼠 mtDNA 上最保守的区域之一，并且不会扩增核基因组 DNA 上的任何脱靶序列。单拷贝参考 (SCR) 引物组可识别并扩增大鼠 17 号染色体上 100 bp 长的区域，并作为数据标准化的参考。已知 mtDNA 拷贝数的参考基因组 DNA 样本可作为计算目标样本 mtDNA 拷贝数的参考。精心设计的引物确保：(i) 高效，实现可靠的定量；(ii) 无非特异性扩增。每个引物组都已通过 qPCR 验证，包括熔解曲线分析和凝胶电泳，以确保扩增特异性，并通过模板连续稀释来验证扩增效率。 2X GoldNStart TaqGreen qPCR Master Mix（目录号：MB6018a-1）是一种基于 SYBR ® Green 染料的 qPCR Master Mix，具有“热启动”特性。它在单个试管中包含 SYBR ® Green、dNTP、Taq DNA 聚合酶和惰性金色上样指示剂。通过 ScienCell 独特的化学修饰 Taq DNA 聚合酶实现的“热启动”特性可最大程度地抑制引物二聚体的形成。先进的缓冲液配方具有出色的特异性和效率，线性动态范围宽。惰性金色上样指示剂可更好地可视化和跟踪 qPCR 板或试管中的样品上样情况。
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较平均 mtDNA 拷贝数
ScienCell 绝对大鼠线粒体 DNA 拷贝数定量 qPCR 检测试剂盒 (ARMQ) 旨在直接比较样本的平均 mtDNA 拷贝数。大鼠 mtDNA 引物组可识别并扩增大鼠 mtDNA 上最保守的区域之一，并且不会扩增核基因组 DNA 上的任何脱靶序列。单拷贝参考 (SCR) 引物组可识别并扩增大鼠 17 号染色体上 100 bp 长的区域，并作为数据标准化的参考。已知 mtDNA 拷贝数的参考基因组 DNA 样本可作为计算目标样本 mtDNA 拷贝数的参考。精心设计的引物确保：(i) 高效，实现可靠的定量；(ii) 无非特异性扩增。每个引物组都已通过 qPCR 验证，包括熔解曲线分析和凝胶电泳，以确保扩增特异性，并通过模板连续稀释来验证扩增效率。 2X GoldNStart TaqGreen qPCR Master Mix（目录号：MB6018a-1）是一种基于 SYBR ® Green 染料的 qPCR Master Mix，具有“热启动”特性。它在单个试管中包含 SYBR ® Green、dNTP、Taq DNA 聚合酶和惰性金色上样指示剂。通过 ScienCell 独特的化学修饰 Taq DNA 聚合酶实现的“热启动”特性可最大程度地抑制引物二聚体的形成。先进的缓冲液配方具有出色的特异性和效率，线性动态范围宽。惰性金色上样指示剂可更好地可视化和跟踪 qPCR 板或试管中的样品上样情况。
Sciencell的绝对大鼠线粒体DNA拷贝数定量QPCR测定套件（ARMQ）旨在直接比较平均MTDNA副本NUM
Sciencell的绝对大鼠线粒体DNA拷贝数定量QPCR测定试剂盒（ARMQ）旨在直接比较样品的平均mtDNA拷贝数。大鼠mtDNA底漆集识别并放大了大鼠mtDNA上最保守的区域之一，并且不会放大核基因组DNA上的任何脱靶序列。单复制参考（SCR）引物集识别并放大了大鼠染色体17的100 bp长区域，并用作数据归一化的参考。具有已知mtDNA拷贝数的参考基因组DNA样品是计算目标样品的mtDNA拷贝数的参考。精心设计的底漆可确保：（i）值得信赖的量化效率高； （ii）没有非特异性扩增。通过QPCR验证了每个底漆集，并通过熔融曲线分析和凝胶电泳进行了扩增特异性，并通过模板系列稀释来验证。2倍Goldnstart Taqgreen QPCR Master Mix（CAT＃MB6018A-1）是SYBR®基于绿色染料的QPCR主混合物，具有“热启动”属性。它包含单个管中的SYBR®绿色，DNTP，TAQ DNA聚合酶和惰性金色载荷指示器。通过Sciencell独特的化学化学TAQ DNA聚合酶实现的“热启动”特性提供了对引物二聚体形成的最大抑制作用。高级缓冲仪公式提供了较高的特异性和效率，并具有较宽的线性动态范围。惰性金色加载指示器允许在QPCR板或试管中更好地可视化和跟踪样品加载。
RNA中的5-甲环环肽的定量测序方法
已经确定了100多种自然发生的RNA修饰，其中一些在基因表达调节中起了各种作用。[1-3]作为真核mRNA中最丰富的内部修饰，n 6-甲基拉丹代氨酸（M 6 A）受动态调节，并参与了mRNA代谢的许多方面，例如替代拼接，[4]核输出，[5]稳定性，[5]稳定性，[6] [6]转换[7,8]和dean。[9]近年来，关于其他mRNA修饰的整个转录组测序的研究也已经出现。报告的排序方法可以分组为：（1）基于抗体的M 6 A 4，M 1 A，[10-13] AC 4 C 14,15，M 5 C 16和HM 5 C 17。这些方法依赖于基于抗体的富集，但既不能达到碱基精度也无法揭示绝对修饰的部分。（2）逆转录（RT）基于停止的方法，例如基于CMC的假喹啉测序[18]和基于低DNTP的2'-O-O-ME测序。[19]尽管这些方法可以以基础分辨率检测修饰位点，但它们通常具有很高的假阳性速率，因为RT停止签名可能是非特定于特定特定的。[20]（3）基于RT突变的AP促进，例如映射M 6 A，[21-24] M 7 G [25-27]和M 1 A [28]的方法，这些方法在修改的位点产生突变特征以实现单个基础分辨率，以低背景。（4）基于RT缺失的方法，例如BS诱导的定量假氨酸测序。[29,30] RNA修饰中的另一个考虑是每个位点的修饰化学计量法。修饰分数是与修饰动力学及其调节功能直接相关的生物学参数。5-甲基胞嘧啶（5MC），5-羟基甲基环胞嘧啶（5HMC）和5-甲基辛糖苷（5FC）是DNA中重要的中间体的DNA修饰，是活性DNA 5MC
引文：Pietra D、Brisci A、Rumi E、Boggi S、Elena C、Pietrelli A、Bordoni R、Ferrari M、Passamonti F、De Bellis G、Cremonesi L 和 Cazzola M. Dee
对于 HRM 检测，采用补充表 S1 中报告的优化内含子引物。PCR 在 20 μ L 中进行，其中包含 100 ng DNA、0.5 单位 HotStart Taq 聚合酶以及 1x 缓冲液（Qiagen，德国希尔登）、1.5 mM MgCl 2、800 μ M dNTP、300 nM 每种引物和 1x EvaGreen（Idaho Technologies，犹他州盐湖城）作为插入染料。循环和 HRM 分析在 Rotor-Gene ™ 6000 实时分析仪上进行，采用以下热方案：95°C 持续 15 分钟（一个循环）；95°C 持续 30 秒，55°C 持续 30 秒，72°C 持续 30 秒（50 个循环）；72°C 持续 10 分钟（一个循环）；熔化温度从 85°C 升至 95°C，每秒上升 0.1°C。使用相关的 Rotor-Gene ™ 6000 系列软件 (v1.7.87) 分析数据。标准化条在前导范围的 88°C 和 88.5°C 之间，在尾随范围的 92.5°C 和 93°C 之间，置信阈值为 90%：如果 HRM 图超出了指定参考基因型的置信范围，则软件会将样本识别为变异。图 S1A 显示了健康受试者和 3 名 MPN 患者的 DNA 样本的 HRM 图谱，这些样本先前已通过微电子微芯片分析进行了基因分型（未显示数据）。患者 PV02_113 为 MPL (W515K) 纯合子（TGG>AAG 转换），其 HRM 曲线相对于野生型序列向左移向较低温度，这与纯合变体导致熔解温度 (Tm) 降低的预期一致。患者 PV04_494 为 MPL (W515A) 纯合子（TGG>GCG 转换）等位基因
mytaqtm DNA聚合酶
重要的考虑因素和PCR优化，最佳条件将从反应到反应，并取决于所使用的模板/引物。5x mytaq反应缓冲液：5x MyTAQ反应缓冲液包括5mm DNTP，15mm MGCL 2，稳定器和增强剂。每个组件的浓度已得到广泛优化，从而减少了进一步优化的需求。其他PCR增强剂，例如HISPEC，Polymate或Betaine等。。引物：正向和反向引物通常以0.2-0.6M的最终浓度使用。我们建议使用0.4M作为最终浓度（即每50 le反应体积的每个引物的下午20点）。 过高的底漆浓度可以降低启动的特异性，从而导致非特异性产物。 设计底漆时，我们建议使用Primer-Design软件，例如Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3）或可单位的10mm和3mm和3mm的阳离子阳离子浓度，或者单位阳离子浓度和分别为10mm和3mm。 引物应具有约60°C模板的熔化温度（TM）：反应中的模板量主要取决于所使用的DNA类型。 对于低结构复杂性（例如质粒DNA）的模板，我们建议使用50pg-10ng DNA每50°L反应体积。 对于真核基因组DNA，我们建议每50 l反应的起始量为200ng DNA，这可以在5ng-5ng-500ng之间变化。 避免在含EDTA的解决方案中重新悬浮模板（例如）很重要 te buffer）由于EDTA螯合免费Mg 2+。每50 le反应体积的每个引物的下午20点）。过高的底漆浓度可以降低启动的特异性，从而导致非特异性产物。设计底漆时，我们建议使用Primer-Design软件，例如Primer3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3）或可单位的10mm和3mm和3mm的阳离子阳离子浓度，或者单位阳离子浓度和分别为10mm和3mm。引物应具有约60°C模板的熔化温度（TM）：反应中的模板量主要取决于所使用的DNA类型。对于低结构复杂性（例如质粒DNA）的模板，我们建议使用50pg-10ng DNA每50°L反应体积。对于真核基因组DNA，我们建议每50 l反应的起始量为200ng DNA，这可以在5ng-5ng-500ng之间变化。避免在含EDTA的解决方案中重新悬浮模板（例如te buffer）由于EDTA螯合免费Mg 2+。初始变性：对于非复合模板，例如质粒DNA或cDNA，建议在95°C下1分钟的初始变性步骤。对于更复杂的模板，例如真核基因组DNA，为了促进DNA的完全融化，需要更长的初始变性时间至3分钟。变性：我们的协议建议在95°C下进行15S循环变性步骤，这也适用于富含GC的模板，但是对于低GC含量（40-45％）模板，可以将变性时间降低到5s。退火温度和时间：最佳退火温度取决于底漆序列，通常比对下的TM低2-5°C。我们建议运行温度梯度以确定最佳退火温度，另外55°C可以用作起点。取决于反应，退火时间也可以减少到5s。
全基因组测序和分析 - Illumina
全基因组测序和分析 - 基于 Illumina Rhabdoid (RT) Illumina 基因组板的文库构建（350-450bp 插入大小）：将 96 孔格式的 2ug 基因组 DNA 通过 Covaris E210 超声处理 30 秒进行碎裂，使用 20% 的“占空比”和 5 的“强度”。双端测序文库是按照 BC 癌症机构基因组科学中心 96 孔基因组 ~350bp-450bp 插入 Illumina 文库构建协议在 Biomek FX 机器人（Beckman-Coulter，美国）上准备的。简单来说，DNA在96孔微量滴定板中用Ampure XP SPRI 珠子纯化（每60uL DNA 40-45uL 珠子），在单一反应中分别用T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行末端修复和磷酸化，然后用Ampure XP SPRI 珠子进行清理，并用Klenow片段（3'到5'外显子减去）进行3' A加尾。用Ampure XP SPRI 珠子清理后，进行picogreen定量以确定下一步接头连接反应中使用的Illumina PE接头的数量。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化接头连接产物，然后使用 Illumina 的 PE 索引引物组，用 Phusion DNA 聚合酶（美国赛默飞世尔科技公司）进行 PCR 扩增，循环条件为：98˚C 30 秒，然后 6 个循环，98˚C 15 秒，62˚C 30 秒，72˚C 30 秒，最后在 72˚C 延伸 5 分钟。使用 Ampure XP SPRI 珠子纯化 PCR 产物，并使用高灵敏度分析（美国珀金埃尔默公司）用 Caliper LabChip GX 检查 DNA 样本。所需大小范围的 PCR 产物经过凝胶纯化（在内部定制机器人中使用 8% PAGE 或 1.5% Metaphor 琼脂糖），并使用 Agilent DNA 1000 系列 II 检测和 Quant-iT dsDNA HS 检测试剂盒使用 Qubit 荧光计（Invitrogen）评估和量化 DNA 质量，然后稀释至 8nM。在使用 v3 化学法在 Illumina HiSeq 2000/2500 平台上生成 100bp 配对末端读数之前，通过 Quant-iT dsDNA HS 检测确认最终浓度。全基因组亚硫酸盐-Seq 文库构建和测序：使用 1-5 mg Qubit（Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德）定量基因组 DNA 进行文库构建，如所述（Gascard 等人，2015 年）。为了追踪亚硫酸盐转化的效率，将 1 ng 未甲基化的 lambda DNA (Promega) 掺入使用 Qubit 荧光法定量的 1 µg 基因组 DNA 中，并排列在 96 孔微量滴定板中。使用 Covaris 超声处理将 DNA 剪切至 300 bp 的目标大小，并使用 DNA 连接酶和 dNTP 在 30o C 下对片段进行末端修复 30 分钟。使用 2:1 AMPure XP 珠子与样品比例纯化修复后的 DNA，并在 40 µL 洗脱缓冲液中洗脱以准备 A 尾；这涉及使用 Klenow 片段和 dATP 将腺苷添加到 DNA 片段的 3' 端，然后在 37o C 下孵育 30 分钟。用磁珠清理反应后，将胞嘧啶甲基化双端接头（5'-AmCAmCTmCTTTmCmCmCTAmCAmCGAmCGmCTmCTTmCmCGATmCT-3' 和 3'-GAGmCmCGTAAGGAmCGAmCTTGGmCGAGAAGGmCTAG-5'）在 30oC 下连接到 DNA 20 分钟，并纯化接头两侧的 DNA 片段珠。在亚硫酸盐转化之前，用 10 个 PCR 循环扩增一份文库片段，并在 Agilent Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 芯片上进行大小测定。扩增子的长度在 200-700 bp 之间。使用 EZ Methylation-Gold 试剂盒（Zymo Research）按照制造商的方案实现甲基化接头连接的 DNA 片段的亚硫酸盐转化。五次循环