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通过潮汐和TIDE对CRISPR基因组编辑的快速定量评估
当前的基因组编辑工具使许多物种中选定的DNA序列的靶向诱变。但是，通过基因组编辑方法引入突变的效率和类型在很大程度上取决于目标位点。因此，很难预测编辑操作的结果。因此，量化突变频率的快速测定对于正确评估基因组编辑作用至关重要。我们开发了两种快速，具有成本效益且容易适用的方法：（1）潮汐，可以准确识别和量化插入和删除（indels），这些插入和删除（indels）在引入双链断裂后出现的（dsbs）； （2）Tider，适用于模板介导的编辑事件，包括点突变。这两种方法仅需要一组PCR反应和标准的Sanger测序运行。通过潮汐或TIDE算法分析序列轨迹（可在https://tide.nki.nl或https://deskgen.com上获得）。例程很容易，快速，并且提供了比当前基于酶的测定更详细的信息。潮汐和TIDE加速基于DSB的基因组编辑策略的测试和设计。
染色体修复辅助途径在酵母中改组
图1 - 酵母中染色体修复（CR）和外源修复（ER）途径的比较。A，ER和CR路径的概述。Cas9介导的DSB可以通过外源或染色体供体修复。er会导致外源供体的整合，而CR会重复现有的染色体供体。b，ER和CR途径的修复效率。使用一个ER供体或越来越多的CR供体引入和修复了CAS9 DSB。修复模板（LPA-REN-LPZ）旨在将LPA-T9-LPZ的CAS9目标位点突变为限制性核酸内切酶识别序列（REN），以促进筛选。对照显示在没有修复模板（无修复）和没有GRNA（无DSB）的情况下描述生存能力。生存能力（已修复的DSB的比例）。错误条代表S.D.三个生物学重复。c，不同大小的CR同源性区域的CR效率。cr模板具有从60 bp到280 bp的长度不等的同源区域，并将其整合到同一染色体基因座中，并用于修复Cas9 DSB。cr生存能力 1B。 错误条代表S.D. 三个生物学重复。1B。 错误条代表S.D. 三个生物学重复。1B。错误条代表S.D.三个生物学重复。
Tardigrade损伤抑制蛋白DSUP ...
tardrade是微小无脊椎动物，能够承受极端的环境条件，包括高辐射水平。tardigrade蛋白DSUP（损伤抑制器）在严重的环境压力和X射线上保护Tardigrade的DNA。在癌细胞中表达时，DSUP可保护DNA免受辐射诱导的单链和双链断裂（DSB）的侵害，增加辐照细胞的存活，并保护DNA免受活性氧。DSUP的这些异常特性表明，了解蛋白质功能如何有助于设计可以在放疗或太空旅行期间保护人类的小分子的设计。在这里，我们研究了DSUP是否在大鼠胚胎培养的皮质神经元中具有保护性。我们发现，在皮质神经元中，密码子优化的DSUP定位于细胞核，令人惊讶地促进了神经毒性，导致神经变性。出乎意料的是，我们发现DSUP表达会导致培养的神经元中DNA DSB的形成。使用电子显微镜，我们发现DSUP促进了染色质凝结。与DSUP在癌细胞中的保护特性不同，神经元中DSUP促进神经毒性，诱导DNA损伤，并重新排列染色质。总的来说，神经元对DSUP敏感，DSUP是神经元细胞中DNA保护的替代替代物。
表达异源重组酶的植物中同源重组的刺激
背景：CRISPR/Cas 和 TALEN 技术的进步激发了人们对植物基因编辑机会的兴奋。CRISPR/Cas 被广泛用于通过诱导靶向双链断裂 (DSB) 来敲除或修改基因，而双链断裂主要通过易出错的非同源末端连接或微同源介导的末端连接进行修复，从而导致可能改变或消除基因功能的突变。尽管此类突变是随机的，但它们发生的频率足以使有用的突变能够通过筛选定期识别。相比之下，用替代等位基因或具有特定特征修饰的拷贝替换整个基因的基因敲入目前还不常见。通过同源定向修复进行基因替换（或基因靶向）在高等植物中发生的频率极低，使得筛选有用事件变得不可行。通过抑制非同源末端连接和/或刺激同源重组 (HR) 可以增加同源定向修复。在这里，我们通过评估多种异源重组酶表达对烟草植物染色体内同源重组 (ICR) 的影响，为提高基因置换效率铺平了道路。结果：我们在含有高度敏感的 β -葡糖醛酸酶 (GUS) 型 ICR 底物的烟草转基因系中以不同的组合表达了几种细菌和人类重组酶。使用病毒 2A 翻译重编码系统实现了多种重组酶的协调同时表达。我们发现大多数重组酶在花粉中显著增加了 ICR，其中 HR 将由减数分裂期间发生的程序化 DSB 促进。DMC1 表达在初级转化体中产生了对 ICR 的最大刺激，其中一种植物的 ICR 频率增加了 1000 倍。对纯合 T2 植物系中的 ICR 的评估表明，ICR 增加了 2 倍到 380 倍，具体取决于表达的重组酶。相比之下，营养组织中的 ICR 仅适度增加，异源重组酶的组成性表达也降低了植物的育性。结论：异源重组酶的表达可以大大增加植物生殖组织中 HR 的频率。将此类重组酶表达与使用 CRISPR/Cas9 诱导 DSB 相结合可能是从根本上提高植物基因替换效率的途径。
酵母中DNA双链断裂周围的染色质景观及其对DNA修复途径选择的影响
摘要：DNA双链断裂（DSB）是有害的DNA病变，如果无法正确修复，这会对基因组稳定性产生灾难性后果。dsb可以通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）来修复。这两种途径之间的选择取决于哪种蛋白质结合到DSB末端以及如何调节其作用。nhej启动了KU复合物与DNA末端的结合，而HR是由5'触发的DNA链的核解度降解引发的，这需要几种DNA核酸酶/解旋酶并产生单链DNA悬垂。dsb修复发生在精确组织的染色质环境中，其中DNA围绕组蛋白八聚体形成核小体。核 - 躯体对DNA末端加工和修复机械施加了障碍。修改DSB周围的染色质组织可以通过去除整个核小体的去除，这要么通过染色质重塑因子的作用，或者是通过染色质重塑因子的作用，或者通过染色体后的转换修改来允许进行正确的DSB修复，从而可以增加染色质的功能，从而增加修复enzymes对DNA的可及性。在这里，我们回顾了酵母酿酒酵母中DSB周围发生的翻译后修饰及其在DSB修复中的作用，并特别注意DSB修复途径选择。
fignl1-firrm对于减数分裂重组至关重要，并防止DNA损伤无关RAD51和DMC1加载
在减数分裂期间，链交换蛋白RAD51和DMC1的核蛋白蛋白质对通过同源重组（HR）修复SPO11生成的DNA双链断裂（DSB）至关重要。正和负RAD51/DMC1调节剂的平衡活性可确保正确重组。类似烦躁的类似1（fignl1）先前显示出对人类细胞中RAD51的负调节。然而，fignl1在MAM-MALS中减数分裂重组中的作用仍然未知。在这里，我们使用男性种系条件敲除（CKO）小鼠模型解读了Fignl1和Fignl1相互作用调节剂（FIRRM）的减数分裂功能。在小鼠精子细胞中完成减数分裂预言所必需。尽管在减数分裂DSB热点对DMC1上有效募集，但晚期重组中间体的形成在FIRRM CKO和Fignl1 CKO精子细胞中仍然有缺陷。此外，Fignl1-FiRRM复合物将RAD51和DMC1的积累限制在完整的染色质上，这是由于SPO11催化的DSB的形成而独立于形成。纯化的人fignl1δn改变了rad51/dmc1核蛋白素的结构，并在体外inshi-bits链链入侵。因此，这种复合物可能在减数分裂DSB的位点调节RAD51和DMC1关联，以促进重组中间体的促进链和处理。
利用DSB维修以促进有效的同源性...
Prime编辑最近作为用于精确基因组编辑的下一代方法。在这里，我们利用DNA双链断裂（DSB）修复来开发两种新型策略，这些策略使用基于SP Cas9核酸酶的Prime Editor（PEN）安装精确的基因组插入。我们首先证明，与常规的Prime编辑指南RNA（PEGRNA）相连，可以有效地通过依赖同源性的DSB修复机制促进短基因组插入。虽然笔编辑导致副产品的水平增加，但它挽救了与基于Nickase的Prime编辑器表现不佳的Pegrnas。我们还提出了一种小分子方法，该方法产生了笔编辑的产物纯度。接下来，我们通过设计一个单个启动插入GRNA（springRNA）来开发同源性独立笔编辑策略，该插入式插入式插入（SpringRNA）通过非同源端连接途径（NHEJ）安装DSB的基因组插入。最后，我们表明，在DSB上进行的笔介导的插入阻止了Cas9诱导的大染色体缺失，并提供了证据表明连续CAS9介导的切割是Cas9诱导的大缺失的一种机制之一。总的来说，这项工作通过利用包括NHEJ在内的不同的DNA修复机制来扩展当前的Prime编辑工具箱，NHEJ代表了哺乳动物细胞中DSB修复的主要途径。
使用 CRISPR/Cas9- 改组酵母基因组...
尽管转座因子之间的同源重组可通过促进染色体重排来驱动酵母基因组进化，但其潜在机制的细节尚未完全阐明。在酿酒酵母基因组中，最常见的转座子类别是逆转录转座子 Ty1。在本文中，我们探讨了 Cas9 诱导的针对 Ty1 因子的双链断裂 (DSB) 如何在该酵母物种中产生基因组改变。在 Cas9 诱导后，我们观察到染色体重排（例如缺失、重复和易位）显著增多。此外，我们发现有丝分裂重组率升高，导致杂合性丧失。通过 Southern 分析结合短读和长读 DNA 测序，我们揭示了逆转录转座子中诱导的重组的重要特征。几乎所有的染色体重排都反映了 Ty1 元件处 DSB 的修复，这是通过非等位基因同源重组实现的；成簇的 Ty 元件是染色体重排的热点。相反，大部分（约四分之三）等位基因有丝分裂重组事件在独特序列中存在断点。我们的分析表明，后一些事件反映了 Ty 元件中产生的断端的广泛处理，这些断端延伸到独特序列中，从而导致断裂诱导的复制。最后，我们发现单倍体和二倍体菌株对用于修复双链 DNA 断裂的途径有不同的偏好。我们的研究结果表明，逆转录转座子中的 DNA 损伤在推动基因组进化方面的重要性。
新型大肠杆菌毒素的合成——……
大肠杆菌是人体肠道正常菌群的一部分，具有重要功能；然而，某些菌株会导致宿主患病，损害肠道功能并对整体健康产生不利影响。大肠杆菌 B2 血清群中的 pks 基因簇编码大肠杆菌素，这是一种次级代谢物和潜在的肠道毒素。然而，大肠杆菌中大肠杆菌素产生的机制很复杂，pks 基因簇的功能尚未完全了解。本综述探讨了大肠杆菌中 pks 岛产生大肠杆菌素的复杂机制和过程，阐明了其中 clbA-S 基因所起的具体作用。并揭示了colibactin对宿主细胞DNA的毒性作用，阐述了可能在诱导结直肠癌发展中起重要作用的机制，如单碱基替换（SBS）、小插入/缺失（small indel）特征（ID-pks）、染色体间连锁（ICLs）、DNA双链断裂（DSBs），这些机制的阐明对相关药物的进一步探索和开发具有重要意义。
系统分析关键 DNA 损伤反应因子的分子和生物物理特性
摘要 DNA 双链断裂 (DSB) 的修复对于保持基因组完整性至关重要。因此，定义 DSB 修复的潜在机制将增强我们对这些途径中的缺陷如何导致人类疾病的理解，并可能导致发现新的治疗干预方法。在这里，我们在 U2OS 细胞中建立了一组 HaloTagged DNA 损伤反应因子，这使得荧光 HaloTag 配体能够进行浓度依赖性蛋白质标记。在这些修复因子的内源位点处基因组插入 HaloTag 可保持表达水平，蛋白质保持适当的亚细胞定位、形成病灶的能力并在功能上支持 DSB 修复。我们系统地分析了总细胞蛋白质丰度，测量了激光诱导的 DNA 损伤位点的募集动力学，并通过活细胞单分子成像确定了扩散动力学和染色质结合特性。我们的工作表明，Shieldin 复合物（端接的关键因子）并不存在于预组装状态，并且这些因子在 DSB 处的相对积累具有不同的动力学。此外，活细胞单分子成像揭示了 MDC1 和染色质之间的组成性相互作用，该相互作用由其 PST 重复域介导。总之，我们的研究证明了单分子成像的实用性，可以为 DNA 修复提供机制见解，这将成为表征活细胞中 DNA 修复因子的生物物理特性的强大资源。